TLN

TLN

サーモリシン（Thermolysin）は、グラム陽性菌であるProteus thermophilusが産生する耐熱性の中性金属プロテアーゼである。酵素活性には亜鉛イオン1個が必須であり、構造安定性にはカルシウムイオン4個が必要とされる。サーモリシンは、疎水性アミノ酸を含むペプチド結合の加水分解を特異的に触媒する。一方で、加水分解の逆反応を利用したペプチド結合形成にも広く用いられている。サーモリシンは、各種Bacillus属菌が産生する金属プロテアーゼファミリーの中で最も安定なメンバーである。これらの酵素は「中性」プロテアーゼ、またはサーモリシン様プロテアーゼ（thermolysin-like proteases：TLN）としても知られる。

合成

好熱性プロテアーゼは、細菌によりまずプロ酵素として合成される。サーモリシンは、28アミノ酸長のシグナルペプチド、204アミノ酸長のプロペプチド、および316アミノ酸長の成熟酵素からなるプロ酵素として合成される。シグナルペプチドは、前駆体サーモリシンの細菌細胞の細胞膜への移行を指示する。続いてペリプラズムにおいて、シグナルペプチダーゼによりシグナルペプチドが切断され、プロサーモリシンへとプロセシングされる。この前駆配列は分子シャペロンとして機能し、前駆配列と成熟配列を連結するペプチド結合の自己切断を誘導する。その後、成熟タンパク質が細胞外培地へ分泌される。

構造

サーモリシンの分子量は34,600 Daである。全体構造は概ね球状の2つのドメインからなり、分子中央を横切る深い裂溝によって両ドメインが分離されている。各ドメインの二次構造は大きく異なり、N末端ドメインは主としてβシートから構成される一方、C末端ドメインは主としてαヘリックスから構成される。両ドメインは、アミノ酸137～151に相当する中央のαヘリックスによって連結されている。加熱や変性に伴いコンフォメーション変化を起こす多くのタンパク質とは対照的に、サーモリシンは少なくとも70°Cまでは顕著なコンフォメーション変化を示さない。

TLNの特性

TLN系列メンバーの熱安定性はT50温度により評価される。すなわち、この温度で30分間インキュベートすると酵素活性が半減する。サーモリシンのT50値は86.9°Cであり、TLN系列の中で最も高い熱安定性を示す。プラスミンの安定性に対するカルシウムの寄与に関する研究では、熱失活後に分子内からカルシウムイオン1個が放出されることが示されている。カルシウムが初期段階で分子に結合できないよう結合部位を改変すると、サーモリシンの安定性は7°C低下する。しかし、カルシウム結合はサーモリシンの安定化に重要であるものの、安定性により決定的なのは、タンパク質表面に位置するN末端ドメインのアミノ酸からなる小さなクラスターである。特に、アミノ酸位置63のフェニルアラニン（F）および位置69のプロリン（P）は、耐熱性タンパク質の安定性に大きく寄与する。Bacillus stearothermophilusが産生する不安定なサーモリシン様プロテアーゼ（TLN-ste）では、これらのアミノ酸がそれぞれスレオニン（T）およびアラニン（A）に置換されており、その結果、安定性は7°C（F63→T）および6.3°C（P69→A）低下し、合計で12.3°C低下する。

参考文献