TLN

TLN

サーモリシンは、グラム陽性細菌プロテウス・サーモフィルスによって生成される熱安定性の中性メタロプロテアーゼです。酵素活性には1つの亜鉛イオンが必要で、構造的安定性には4つのカルシウムイオンが必要です。サーモリシンは、疎水性アミノ酸を含むペプチド結合の加水分解を特異的に触媒することができます。しかし、サーモリシンは加水分解の逆反応を通じてペプチド結合を形成するためにも広く使用されています。サーモリシンは、さまざまなバチルス種によって生成されるメタロプロテアーゼファミリーの中で最も安定したメンバーです。これらの酵素は「中性」プロテアーゼまたはサーモリシン様プロテアーゼ（TLN）としても知られています。

合成

好熱性プロテアーゼは、まず細菌によって合成される前駆体酵素です。サーモリシンは、28アミノ酸からなるシグナルペプチド、204アミノ酸からなる前ペプチド、316アミノ酸からなる成熟酵素で構成される前駆体酵素として合成されます。シグナルペプチドは、プロトヘモリシンを細菌細胞の細胞膜に転送する信号を送ります。その後、ペリプラズム内で、シグナルペプチダーゼによってプロリシンがプロリシンに処理されます。この前配列は分子シャペロンとして機能し、前配列と成熟配列を結ぶペプチド結合の自動切断を引き起こします。その後、成熟したタンパク質が細胞外媒体に分泌されます。

構造

サーモリシンの分子量は34,600 Daです。その全体の構造は、2つのほぼ球状のドメインで構成されており、分子の中央を横切る深い亀裂が2つのドメインを分けています。各ドメインの二次構造はかなり異なります。N末端ドメインは主にβシートで構成されているのに対し、C末端ドメインの構造は主にαヘリックスです。2つのドメインは、アミノ酸137-151を跨ぐ中央のアルファヘリックスによって接続されています。加熱や変性中に構造変化を受ける多くのタンパク質とは対照的に、サーモリシンは少なくとも70°Cまでは主要な構造変化を受けません。

TLNの特性

TLNシリーズメンバーの熱安定性はT50温度で測定されます。この温度で30分間インキュベーションすると、酵素活性が半分に減少します。サーモリシンのT50値は86.9°Cであり、TLNシリーズの中で最も熱的に安定したメンバーです。プラスミンの安定性に対するカルシウムの寄与に関する研究では、熱不活化後に分子内で1つのカルシウムイオンが放出されることが示されています。カルシウムが最初に分子に結合するのを防ぐために結合部位を変更することにより、サーモリシンの安定性は7°C低下します。しかし、カルシウム結合は好熱性プロテアーゼの安定化に重要な役割を果たしますが、安定性にとってより重要なのは、タンパク質の表面に位置するN末端ドメインのアミノ酸の小さなクラスターです。特に、アミノ酸位置63のフェニルアラニン（F）とアミノ酸位置69のプロリン（P）は、熱可溶性タンパク質の安定性に大きく寄与しています。バチルス・ステアロサーモフィルス（TLN-ste）によって生成される不安定な好熱性プロテアーゼでは、これらのアミノ酸がそれぞれスレオニン（T）とアラニン（A）に変更され、安定性が7°C（F63→T）および6.3°C（P69→A）低下し、安定性は12.3°C低下します。

参考文献