RecAf

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相同組換えは、DNA二本鎖切断、鎖間交差、崩壊した複製フォークの修復において重要な役割を果たし、これらの機能はゲノムの完全性を維持するために不可欠です。また、細菌から人間までの遺伝的多様性を生み出す上でも重要な役割を果たします。組換えの核心反応は、二つの相同DNA分子間での鎖の交換であり、このプロセスはRecAファミリーのATPaseによって触媒されます。

RecAは、ATP依存的にssDNAと結合し、1回転あたり約6.2のRecAタンパク質と約3のヌクレオチドを持つ螺旋状のヌクレオプロテインフィラメントを形成します。DNAは、1回転あたり18.5のヌクレオチドを持つ形に巻き戻され、ヌクレオチドあたり平均5.1Åの上昇を持ちます。

rec遺伝子の探索

クラークとマルグリーズは、1965年に遺伝子スクリーニングで初めてrecAを特定しました。彼らはF^-細菌を突然変異させ、Hfr供与株と再結合できない株をスクリーニングしました。その後の研究により、recAは相同組換えのRecBCD経路とRecF経路の両方に不可欠であり、recA変異体はDNA修復、SOS突然変異、細胞分裂、染色体分離、λプロファージ誘導など、複数の機能を持つことが示されています。

recA遺伝子が発見されてから10年後、タンパク質は初めて精製され、その広範な生化学的活性が報告されました。これには、DNA結合、ATP加水分解、DNA上でのフィラメント形成能力、相同DNA鎖の交換能力が含まれます。研究によると、RecAは38 kDaのタンパク質で、各細胞に約1,000のモノマーが発現し、ssDNAおよびdsDNA上に右手のヌクレオプロテインフィラメントを形成します。

DNA損傷がない場合、in vivoのRecA濃度は約1 μMですが、SOS応答中はRecAの濃度が約10倍に増加します。ATP結合ヌクレオプロテインフィラメントは、DNAの相同配列を探索し捕捉するための表面触媒として機能します。相同領域が見つかると、相同染色体上のssDNA鎖が交換され、ヘテロ二重鎖DNAが生成されます（つまり、各単鎖は異なる染色体からのものです）。 

構造的手がかりの探索：電子顕微鏡からの洞察

過去30年間、高解像度の電子顕微鏡を通じて、RecAヌクレオプロテインフィラメントに関するほとんどの情報が得られ、組換えプロセス中のヌクレオプロテイン構造の形態変化についての理解が深まりました。生理的条件下では、ssDNAは複数の構造に折りたたまれ、短い相補的領域の局所的なアニーリングによって安定化され（二次構造）、RecAフィラメントの形成を抑制します。DNAの二次構造は、ssDNA結合タンパク質（SSB）によって大部分克服され、SSBはssDNAに強く結合し、二次構造を効果的に変性させます。

SSBでコーティングされたssDNAは、dsDNAよりも密度が高く、RecAフィラメントとは形態が異なります。なぜなら、各SSBのテトラマーが30-70ヌクレオチドを自分自身の周りに巻きつけているからです。RecAフィラメントがATPと共に形成され、大量のADPを生成するために加水分解されると、RecAフィラメントは単一のフィラメントに沿ってピッチが不均一になります。これは、局所的かつ協調的なATP加水分解モデルと一致しています。変異型RecAタンパク質はssDNAに結合しATPを加水分解する能力を持っていますが、ssDNAを標準的なフィラメントの長さに伸ばすことができないため、シナプシスやDNA鎖の交換を触媒することができず、DNA鎖の交換にはDNAを伸ばすことが必要であることを示しています。

図1. a. DNAフリーのRecAの電子顕微鏡画像、RecAの異種オリゴマー化状態を示す。
b. SSBコーティングされた円形ssDNA上でのRecAフィラメント形成の電子顕微鏡画像（Bell, J.C.; Kowalczykowski, S.C. 2016）

RecA-ssDNAフィラメントの全体構造

RecAは、30残基のアミノ末端a2bモチーフ、240残基のα/β ATPaseコア、64残基の球状ドメイン（CTD）から構成され、ATPaseコアを使用してssDNAに結合します。ADP-AlF₄-Mgは、二つのRecAプロモーターの界面に結合し、ssDNAはフィラメント軸に非常に近い位置にあり、それを巻きつけています。

塩基の平面はフィラメント軸に対して大まかに直交しており、そのワトソン-クリックのエッジは1.0Å以内にあり、DNAの骨格は軸の遠端に位置しています。ssDNAの端は、融合タンパク質のN末端RecAに結合します。

RecA-ssDNAフィラメントは、以前の結晶フィラメントとは異なり、主に組換え酵素のフィラメント軸に対する相対的な方向が異なり、DNA結合要素の位置と位置におけるRecA-RecAの関係とは異なります。

図2. 前シナプスヌクレオプロテインフィラメントの構造（Chen, Z.C.; et al. 2008）