ポリリン酸キナーゼ

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序論

無機ポリリン酸（polyP）は、リン酸無水結合により連結された直鎖状のP_iポリマーである。polyPは自然界のあらゆる細胞に存在し、前生物的時代から保存されてきた可能性があることが研究により示されている。細菌におけるpolyPの重要性は十分に実証されている。栄養制限や環境ストレス下では、多くのグラム陰性菌が迅速にpolyPを産生する。polyPは多面的な機能を有し、転写レベルでrpoSおよびrecAの発現を制御し、さらに多くのストレス誘導性遺伝子および定常期誘導性遺伝子の発現に影響を及ぼす。加えて、polyPはLonプロテアーゼを介したリボソームタンパク質の分解も制御する。  

これらの欠乏状態およびストレスシグナルが、どのようにしてpolyPの蓄積に至るのかは明らかではない。ポリリン酸キナーゼ（PPK、PPK1とも呼ばれる）は、ATPのγリン酸をpolyPへ可逆的に変換する反応を触媒する。主要なヒト病原菌（Pseudomonas aeruginosaなど）におけるppk遺伝子の欠失実験により、細菌の病原性におけるpolyPおよびPPKの重要性が示されている。PPKは運動性、バイオフィルム形成、クオラムセンシングにも必須であり、これらは病原体の抗菌薬耐性に重要な寄与をする。特筆すべき点として、病原因子の放出にもPPKの関与が必要である。polyPは定常期における生存に必須であることから、PPK阻害剤は非増殖菌の根絶に寄与する可能性がある。現在、E. coliのPPKは十分に特性解析された酵素となっている。精製した組換えPPKはpolyP鎖の伸長反応を継続して触媒し、polyP鎖が約750個のリン酸基に達すると触媒反応を終結する。

Escherichia coli PPKの全体構造

リガンド非結合型およびAMPPNP結合型の全長E. coli PPKの結晶構造が、同一の結晶格子内で2.5 Å分解能にて決定された。結晶格子において、各非対称単位は基本的に同一構造のPPKモノマー2分子を含み、これらは擬似2回対称により関係付けられ、相互に噛み合った二量体構造を形成する。AMPPNPがPPKに結合しても、モノマーのコンフォメーション変化はわずかである。各PPKモノマーは4つのドメインからなるL字型構造を有する。これらのドメインは、アミノ末端ドメイン、「ヘッド」ドメイン（Hドメイン）、および互いに近縁な2つのカルボキシ末端ドメイン（C1ドメインおよびC2ドメイン）から構成される。 Nドメインは残基2–106からなり、C末端ドメイン上面に位置する3本の逆平行な長いαヘリックス束で構成される。NドメインはPPKの高度に保存された領域であり、ATPのアデニン環に対する上部結合界面を提供する。C1およびC2ドメインはそれぞれ残基322–502および503–687から構成され、PPKファミリー内で高度に保存されている。ヘリックスおよびβシートは異なる構造トポロジーと相対配向を示す。研究により、酵素触媒活性に必須の一部残基がこれら2つのドメインに局在することが示されている。

図1．Escherichia coliポリリン酸キナーゼ（PPK）の全体構造（Zhu, Y.; et al. 2015）

PPK自己リン酸化の化学機構

PPKの自己リン酸化はポリリン酸合成の第一段階であることが示されており、変異導入研究によりH435およびH454がPPKの自己リン酸化部位である可能性が示唆されている。PPK-AMPPNP結晶構造では、H435が「逆」位置からAMPPNPのγリン酸基と直接相互作用する一方、H454はC1ドメインの疎水性コアに完全に埋没している。この結果は、H435がPPKの唯一の自己リン酸化部位であることを裏付ける証拠となる。 一部の研究者は、PPKのH435が求核剤としてATPのγリン酸基のリン酸ジエステル結合を攻撃し、H592が一般酸としてβリン酸とγリン酸の間の酸素原子をプロトン化すると推定している。C1およびC2ドメインには、鍵となる水素結合を形成する高度に保存されたアミノ酸が4つ存在する：E623はH435と、D470はH592とそれぞれ相互作用する。D470の想定される役割は、一般酸であるH592を結合し、正しい配向に整えることである。このモデルは、H435QおよびH592Q変異体が自己リン酸化できなかったという既報の生化学的研究結果と整合する。

図2．PPK自己リン酸化に関する提唱化学機構（Zhu, Y.; et al. 2015）