ポリヌクレオチドキナーゼ

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T4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）は、元々T-イーブンファージに感染したE. coliのタンパク質抽出物から発見され、現在では分子生物学研究で使用される主要な試薬となっています。T4早期遺伝子pseTの産物であるPNKは、アデノシン三リン酸（ATP）や他のヌクレオシド三リン酸からポリヌクレオチドの5'-ヒドロキシル基へのγ-リン酸基の転送を触媒します。二本鎖および一本鎖のDNA、RNA、個々の3'-リン酸ヌクレオチド塩基は、この酵素の基質として使用できます。さらに、この酵素は複数の基質に対して5'-ヒドロキシルキナーゼおよび2', 3'-環状ホスホジエステラーゼ活性を持っています。PNKと保存されたモチーフを共有するDNA修復酵素が真核生物で同定されています。PNKは2つの機能ドメインを含み、ホモテトラマーを形成します。C末端のリン酸ドメインはL-2-ハロ酸脱ハロゲン化酵素ファミリーに相同であり、N末端ドメインはアデニル酸キナーゼに相同です。

PNKの機能ドメイン

T4 PNKは301アミノ酸のポリペプチドのホモテトラマーです。核酸生化学で広く使用されているにもかかわらず、この二機能酵素の構造とメカニズムはまだ不明です。初期の研究では、PNKのC末端が3'-ホスファターゼ機能に関与し、N末端が5'-キナーゼ反応に関与していることが示されています。いくつかの研究では、サイト特異的変異導入を使用して5'-キナーゼおよび3'-ホスファターゼ活性の活性部位の基本的な構成を特定しました。5'-キナーゼ反応を触媒するために必要なアミノ酸（Lys15、Ser16、Asp35、Arg38、Asp85およびArg126）は主にN末端に存在し、3'-ホスファターゼ機能に必要な残基（Asp165、Asp167、Arg176、Arg213、Asp254およびAsp278）は主にC末端に集中しています。これらの結果は、Arg126とAsp165の間にドメイン境界が存在することを示しています。C末端のホスファターゼドメインは安定したダイマーを形成でき、N末端ドメインは酵素がダイマーからテトラマーに移行するために必要です。研究はまた、PNKの5'-キナーゼドメインと3'-ホスファターゼドメインがドメイン境界で物理的に分離でき、5'-キナーゼ活性がPNKのオリゴマー化によって影響を受ける可能性があることを示しています。  

キナーゼドメインの結晶構造

現在、PNKのN末端キナーゼドメインPNK（1-181）が解決されています。この構造は、PNK残基1から152までの連続したポリペプチドを含み、N末端のHisタグとC末端のアミノ酸153から181までの断片（ホスファターゼドメインの近位断片）は無秩序で電子密度がありません。キナーゼドメインは、両側に3つのαヘリックスを持つ中央の4本の平行βシートで構成されています。最初のβストランドと最初のαヘリックスの間にはウォーカーモチーフ（⁹GxxGxGKS¹⁶）があります。多くのヌクレオチド依存性ホスホトランスフェラーゼに見られる古典的なPループ構造がAボックスに見られます。また、PNK構造にはPループとα2に結合する2つの硫酸イオンもあります。非対称単位のキナーゼモノマーは、結晶学的2重軸を介して別のモノマーと接触しており、α2–α3ループとα1、β2、α2、α3が2400 Ų（プロトマーあたり1200 Ų）の接触面を形成しています。界面の分子は主に疎水性ですが、主鎖（Asn31アミドからIle41カルボニルまで）、側鎖から主鎖（Asn31アミドからSer40カルボニルまで）、および側鎖から側鎖（Asp36 Oδ1からHis44Nε; Asp36 Oδ2からHis44NεおよびSer40 Oγ）との間の水素結合も含まれています。

Fig 1. 5′-キナーゼドメインの構造 (Wang, L.K.; et al. 2002)

PNK活性部位

PNKの三次構造には2つの秩序ある硫酸イオンがあります。最初の硫酸はPループのバックボーンアミド窒素およびAボックスのLys15およびSer16残基と広範に接触しており、Lys15およびSer16は5'-キナーゼ活性に不可欠です。PNK結晶における硫酸とPループの相互作用のネットワークは、多くの他のPループを含むホスホトランスフェラーゼの構造におけるヌクレオチドβリン酸への接触を表しています。したがって、硫酸がPNKのNTP結合部位を定義していると推測できます。三次構造の2番目の硫酸イオンは、他のPループを含むホスホトランスフェラーゼのリン酸受容体部位に対応しており、最初の硫酸イオンから8.5Å離れています。2番目の硫酸はThr86の主鎖アミド窒素および側鎖Oγ、α2のArg38の2つの末端グアニジニウム窒素と配位しています。

Fig 2. PNK活性部位 (Wang, L.K.; et al. 2002)