PNK

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はじめに

ポリヌクレオチドキナーゼ（Pnk）は、リチャードソンおよびハーウィッツ研究所によって、T4およびT2バクテリオファージに感染した大腸菌で発見されました。バクテリオファージT4 Pnkを使用して5'DNAまたはRNA末端に³²Pをラベル付けすることで、核酸構造、分子クローニング、核酸配列決定の方法の開発が促進されます。T4 Pnkが組換えDNA研究において重要であることはよく知られていますが、その「RNA修復」経路への貢献はあまり広く認識されていませんin vivo. T4感染中、細菌は宿主細胞内のtRNAの部位特異的切断を誘導することによってT4タンパク質合成を抑制しようとし、ファージはPnkとファージコーディングRNAリガーゼを使用して壊れたtRNAを修復します。T4 Pnkは、この経路においてATPからRNAの5'OH末端へのγリン酸の転送と、RNAからの3'PO₄末端の加水分解的除去を触媒します。真核生物のtRNAスプライシングには、一連の類似反応が必要です。分裂酵母や多細胞動物では、5′ OH DNA末端のリン酸化に特化したPnkオルソログが、酸化、放射線、トポイソメラーゼI毒によって引き起こされるDNA損傷の修復に重要な役割を果たします。酵素の作用メカニズムをより深く理解するためには、構造解析にもっと努力する必要があります。

キナーゼドメインの結晶構造

科学者たちは、Pnk残基1から152までの連続ペプチドを含むN末端キナーゼドメインPnk（1-181）を結晶化しました（N末端HisタグおよびC末端セグメントはアミノ酸153から181までが無秩序です）。キナーゼドメインは、4本の平行βシート（β2-β3-β1-β4）で構成されており、各側に3つのαヘリックスがあります。ヘリックスα1、α5、およびα6はβシートの左側に位置し、α2、α3、およびα4は右側に位置します。このキナーゼは、最初のβ鎖と最初のαヘリックスの間にコンセンサスウォーカAボックスモチーフ（⁹GxxGxGKS¹⁶）を含んでいます。Pnkに結合した2つの硫酸イオンのうちの1つはPループに結合し、もう1つはα2およびβ3とα4を接続するループに結合してNTPおよびリン酸受容体結合部位をそれぞれ分離します。キナーゼは2つのサブドメインに分けることができます。一つは2つの硫酸を支える球状の台座であり、もう一つの二部構成モジュールは硫酸結合部位の上にある蓋のような構造を含んでいます。キナーゼモノマーは結晶学的2重軸を介して別のモノマーと接触し、相互作用界面の表面積は2400 Ų (1200 Ų あたりの原生生物)です。界面での分子接触は主に疎水性です。

図1. 5′-キナーゼドメインの構造。中央のβシートが緑色で、両側のαヘリックスが紫色で示されています（Wang, L.K.; et al. 2002）

Pnk 活性部位

2つの硫酸イオンは、Pnkの三次構造内で重要な配位役割を果たします。具体的には、最初の硫酸はPループのバックボーンアミド窒素および残基Lys15およびSer16の側鎖と広範に接触しています。科学者たちは、この硫酸がPnkのNTP結合部位を定義していると推測しています。Arg126はリジンによって機能的に置き換えることができず、NTP基質との二座配位相互作用の重要性を強調しています。Arg126はNTP結合部位を覆う蓋サブドメインの一部であり、モチーフ¹²²RxxxR¹²⁶内に位置しています。2番目の硫酸イオンは最初の硫酸イオンから8.5 Å離れており、主鎖アミド窒素およびThr86の側鎖Oγ、さらにArg38の両端のグアニジン窒素と配位しています。Arg38の側鎖は3'CMPのリン酸化に非常に重要です。変異解析は、硫酸（3'リン酸）がThr86の主鎖アミドと接触することが不可欠である可能性を示しました。隣接するAsp85の側鎖がアラニンに置き換えられた結果、機能が失われました。Asp85はArg34の主鎖アミドおよびGln64の側鎖アミド窒素と二座水素結合を形成し、Thr86-NHが基質と結合するための正しい位置に固定されることを可能にします。アスパラギン酸はCPTの同等位置（Asp93）で保存されています。

図2. Pnk活性部位（Wang, L.K.; et al. 2002）