PNK

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序論

ポリヌクレオチドキナーゼ（Pnk）は、T4およびT2バクテリオファージに感染した大腸菌において、Richardson研究室およびHurwitz研究室により発見された。バクテリオファージT4由来Pnkを用いてDNAまたはRNAの5′末端を³²Pで標識することにより、核酸構造解析、分子クローニング、核酸シーケンシングの手法開発が促進された。組換えDNA研究におけるT4 Pnkの重要性は広く知られている一方で、in vivoにおける「RNA修復」経路への寄与は十分に認識されていない。T4感染時、細菌は宿主細胞内のtRNAに部位特異的切断を誘導することでT4タンパク質合成を阻害しようとするが、ファージはPnkおよびファージコードのRNAリガーゼを用いて切断tRNAを修復する。この経路においてT4 Pnkは、ATPからγリン酸をRNAの5′OH末端へ転移する反応、およびRNAの3′PO₄末端を加水分解的に除去する反応を触媒する。真核生物のtRNAスプライシングにも、同様の一連の反応が必要である。分裂酵母および後生動物では、5′OH DNA末端のリン酸化に特異的なPnkオルソログが、酸化、放射線、トポイソメラーゼI阻害剤（ポイズン）により生じるDNA損傷の修復において重要な役割を担う。本酵素の作用機序をより深く理解するためには、構造解析に一層注力する必要がある。

キナーゼドメインの結晶構造

研究者らは、N末端キナーゼドメインPnk（1–181）を結晶化した。本構造にはPnk残基1～152からなる連続ペプチドが含まれ（N末端HisタグおよびC末端のアミノ酸153～181の領域は無秩序である）、キナーゼドメインは4本鎖の平行βシート（β2–β3–β1–β4）から構成され、その両側にそれぞれ3本のαヘリックスが配置される。α1、α5、α6はβシートの左側に位置し、α2、α3、α4は右側に位置する。本キナーゼは、第1β鎖と第1αヘリックスの間にコンセンサスWalker A-boxモチーフ（⁹GxxGxGKS¹⁶）を有する。Pnkには2個の硫酸イオンが結合しており、一方はP-loopに結合し、他方はα2およびβ3とα4を連結するループに結合して、それぞれNTP結合部位およびリン酸受容体結合部位を規定している。キナーゼは2つのサブドメインに区分できる。1つは2つの硫酸イオンを支持する球状の基台であり、もう1つの二分モジュールは硫酸結合部位の上方に位置する蓋状構造を含む。キナーゼ単量体は結晶学的2回対称軸を介して別の単量体と接触し、相互作用界面の表面積は2400 Ų（プロトマー当たり1200 Ų）である。界面における分子間接触は主として疎水性相互作用である。

図1．5′キナーゼドメインの構造。中央のβシートを緑、両側のαヘリックスを紫で示したステレオリボン図（Wang, L.K.; et al. 2002）

Pnkの活性部位

2個の硫酸イオンは、Pnkの三次構造内で重要な配位的役割を担う。具体的には、第1の硫酸イオンはP-loopの主鎖アミド窒素ならびに残基Lys15およびSer16の側鎖と広範に接触する。研究者らは、この硫酸イオンがPnkのNTP結合部位を規定すると推定している。Arg126はリジンでは機能的に代替できず、NTP基質との二座相互作用の重要性が示唆される。Arg126はNTP結合部位を覆う蓋サブドメインの一部であり、モチーフ¹²²RxxxR¹²⁶内に位置する。第2の硫酸イオンは第1の硫酸イオンから8.5 Å離れており、Thr86の主鎖アミド窒素および側鎖Oγ、ならびにArg38の末端グアニジノ窒素2個の双方と配位している。Arg38の側鎖は3′CMPのリン酸化に極めて重要である。変異解析により、硫酸イオン（3′リン酸）とThr86の主鎖アミドとの接触は不可欠である可能性が示され、隣接するAsp85側鎖をアラニンに置換すると機能喪失が生じた。Asp85はArg34の主鎖アミドおよびGln64の側鎖アミド窒素と二座の水素結合を形成し、Thr86-NHが基質結合に適した正しい位置に固定されるようにしている。同等位置にはCPTにおいてもアスパラギン酸（Asp93）が保存されている。

図2．Pnk活性部位（Wang, L.K.; et al. 2002）