P2O

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酵素について

ピラノースオキシダーゼ（P2O、EC 1.1.3.10）は、グルコース‐メタノール‐コリン（GMC）酸化還元酵素スーパーファミリーに属するフラビン依存性酸化還元酵素である。P2Oは、D-グルコースおよびその他の単糖基質をC2位で酸化し、同時に分子状酸素を過酸化水素へ還元する反応を担う。P2Oは木材分解性真菌に存在する。P2Oにより生成される過酸化水素は、リグノセルロース分解に関与する他の酵素の反応駆動源（fuel）とみなされることから、補助活性（Auxiliary Activities）ファミリー3（AA3_4）にも分類される。本酵素は1968年にSpongipellis unicolorの菌糸体から発見された。真菌由来P2Oの結晶構造はPDBから取得可能であり、さらに多数のP2O変異体の構造も解明されている。

GMCファミリーの他のメンバーと同様に、P2Oはフラビン結合ドメインと基質結合ドメインから構成される。フラビン結合ドメインにはβαβ型のモノヌクレオチド結合モチーフが含まれ、フラビンタンパク質全体で高度に保存されている。一方、基質結合ドメインは配列多様性が大きく、異なる電子供与体基質に対する選択性を反映している。真菌由来P2Oは4つの同一モノマーからなるホモ四量体として形成され、各モノマーは活性部位のヒスチジン残基に共有結合したフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を含む。真菌由来P2Oの四量体構造には大きな中央空洞が観察され、これは4つすべての活性部位に連結している。この中央空洞は、基質が活性部位へ進入するために必要なチャネルとして機能する。ホモ四量体を形成する各サブユニット間の相互作用は、隣接サブユニットを取り囲むように伸長するオリゴマー化アーム、サブユニット間相互作用を担うループ、ならびにヘッドドメインと呼ばれる小ドメインを含むオリゴマー化構造によって媒介される。

図1．Trametes ochracea由来四量体ピラノースオキシダーゼ（1TT0）の2サブユニット。活性部位入口を外部から隔離する中央空洞（黒枠）を示す（Abrera, A.T.; et al. 2020）

図2．Trametes ochracea由来ピラノースオキシダーゼ（1TT0）における、内部空洞へ通じるチャネル入口の拡大図（Abrera, A.T.; et al. 2020）

バイオセンサーにおける過去および現在の利用

P2Oベースのバイオセンサー開発は、これまで新規酵素の探索、変異体の作製、電子移動の増強等を含む関連研究の対象であり続けてきた。現在では、各種生体分子を検出するP2Oベース機器の適用が増加しており、食品産業、疾患診断、生物学的プロセスのモニタリングおよびスクリーニング等に応用されている。バイオセンサーの生体触媒要素としてのP2Oは、グラッシーカーボン、白金、金、スクリーン印刷電極を含む各種電極上で実証されている。センサーの総合的な生体性能を改善するため、他のプラットフォームにおいても引き続き評価が進められている。P2Oが汎用的なバイオセンサーとして利用される主因はグルコースとの反応性にあるが、P2Oは他の糖も検出可能であるため、P2Oベースのバイオセンサーの適用範囲は他の炭水化物の検出へも拡張されている。

これらのバイオセンサー研究では、真菌由来の異なるP2Oが専ら使用されてきた。Lidén et al.の研究では、P. chrysosporium由来P2O（PcP2O）と西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）をカーボンペースト電極（CPE）上に共固定化し、この二酵素バイオセンサーによりH₂O₂およびグルコースの両方を検出した。P2Oとグルコースの反応で生成したH₂O₂はHRPにより消費され、その後HRPとグラファイト電極間で電子移動が生じる。この二酵素バイオセンサーは各種炭水化物に対して良好な応答を示す。さらに多年を経て、食品・飲料分野における各種食品加工プロセスのモニタリング用途として、P2Oベースのバイオセンサーが開発されてきた。Coriolus sp.由来P2O（CsP2O）をカーボンペースト電極上に固定化した系は、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、マルトースの検出に初めて適用された。 

酵素およびバイオセンサーにおける最大の課題

P2Oの酸素ターンオーバー率はGOxより低いものの、酸素に対して相当の活性を示す。触媒過程における酸素の過酸化水素への還元は、特に低電位条件下で感度に干渉する。酸素との反応性は、電子リークを引き起こし得るため、バイオセンサーおよびバイオ燃料電池（BFC）用途において必須の特性ではない。さらに、H2O2は酸化的損傷を惹起し、酵素失活の原因となり得る。この課題を解決するため、研究者らは酵素工学によりP2Oの酸素反応性を改変することに成功している。