乳酸オキシダーゼ

乳酸オキシダーゼ（Lox、EC 1.1.3.2）は、α-ヒドロキシ酸の酸化を触媒するホモテトラマー型フラボプロテインです。この酵素の系統名は（S）-乳酸：酸素 2-オキシドレダクターゼ（脱炭酸化）です。一般的に使用される他の名称には、乳酸酸化脱炭酸酵素、乳酸オキシダーゼ、乳酸酸素化酵素、乳酸オキシゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、L-乳酸モノオキシゲナーゼ、乳酸モノオキシゲナーゼ、L-乳酸-2-モノオキシゲナーゼが含まれます。L-乳酸オキシダーゼは、グリコレートオキシダーゼ、L-乳酸オキシダーゼ、L-乳酸モノオキシゲナーゼ、フラボシトクロム b₂、および長鎖α-ヒドロキシ酸オキシダーゼ、L-マンデレート脱水素酵素を含むFMN含有酵素ファミリーの新しいメンバーです。

構造

FMN酵素の結晶構造において、補因子であるイソアロキサジン系はほぼ常に曲がった、したがって還元型の形で存在しますが、チオレドキシンの構造では酸化型と還元型の両方が存在します。還元型補因子は、イソアロキサジン環系のC4におけるペルオキソ付加物によって再生されます。グリコレートオキシダーゼ（GLO）、マンデレートオキシダーゼ（MDH）の可溶性キメラ型、長鎖ヒドロキシ酸オキシダーゼ（HAO）、およびフラボシトクロム b₂（B2）の4つの関連酵素の構造はX線結晶構造解析によって決定されました。これらの構造において、各モノマーは古典的な8本のストランドからなるα/β-バレルを含み、FMN補因子と基質の結合部位はβ-バレルのC末端に位置しています。GLOおよびHAOでは、生物学的に活性なユニットはわずかに回転した2つのテトラマーから構成されています。MDHの活性ユニットはテトラマーを含みますが、B2ではFMN結合部位と基質結合部位を持つ2つのα/β-バレルを含むヘテロダイマーです。B2は反応メカニズムを解明するための研究対象であり続けていますが、他の化合物とはやや異なり、1つの鎖が電子移動に関与するヘムユニットを含んでいるため、補因子の再生は異なる経路を通じて進行します。

乳酸オキシダーゼ（LOX）の非対称単位は、2つの密に詰まったテトラマーを含んでいます。各テトラマーは生物学的に活性なユニットを形成し、グリコレートオキシダーゼに似た内部422対称性を持っています。各LOXテトラマーのサイズは約50х100х100 Åで、そのC末端は中央の孔を埋めるように折りたたまれています。各LOXモノマーは互いに良く重ね合い、二乗平均平方根（r.m.s.）偏差は0.19-0.69 Åの範囲にあります。最も類似しているのはCとFで、最も異なるのはCとEです。以下の議論はLOXのモノマーAに基づいています。LOXテトラマーは、結晶学によって生成されたGLOテトラマーに重ね合わされ、1268 C^α原子に対してr.m.s.偏差は1.24 Åでした。各LOXサブユニットの374アミノ酸は、バレルの底に2つの短いβストランドを持つα/β-バレルに折りたたまれています。1つのモノマーは異なるサイズの15のαヘリックスを含んでいます。FMN結合部位と活性部位はβ-バレルのC末端に位置し、LOXの残基190-220が活性部位の蓋のような構造を形成しています。この領域は配列アライメントで保存状態が悪く、GLO、HAO、およびB2の構造では無秩序です。

図1. L-乳酸オキシダーゼテトラマー、非対称単位の半分を説明しています。（Leiros I. 2006）

図2. L-乳酸オキシダーゼテトラマーのモノマー構造。（Leiros I. 2006）

触媒メカニズム

乳酸オキシダーゼはFMN依存性酵素の1つで、α-ヒドロキシ酸をα-ケト酸に変換する反応を触媒し、FMN補因子の2電子還元を通じて行われます。このメカニズムの詳細はまだ議論されていますが、最終的には還元型補因子から分子酸素への2つの電子と2つのプロトンの移動につながり、水素過酸化物とα-ケト酸を生成し、最終的に酸化型補因子を生成します。この反応は、連続的な還元と酸化のステップを持つピンポンメカニズムを通じて進行します。最初のステップは、基質のα-炭素から隣接する塩基を使ってプロトンを抽出し、カルバニオンを生成し、その後2つの電子を補因子に移動させることです。

応用

乳酸濃度は、患者の健康状態や病気の研究を評価するための臨床診断において重要なパラメータとして広く使用されており、手術、スポーツ医学、ショック/外傷、食品産業における継続的なモニタリングにも利用されています。乳酸の定量に最も一般的に使用される分析方法には、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、蛍光、比色、化学発光、磁気共鳴分光法が含まれます。これらの方法は結果を提供しますが、サンプル準備に時間がかかる、費用が高い（高価な機械と訓練された人材が必要）などの欠点があります。しかし、バイオセンサーはこれらの制限を克服できます。乳酸検出に使用できるさまざまな方法と比較して、バイオセンシング方法は、シンプルさ、直接性、リアルタイム性、サンプル準備なし（サンプル希釈が必要な場合もあります）、迅速な応答と高い特異性、経済性と効率性の利点があります。酵素結合バイオセンサー電極の概念は、酵素を電極表面の近くに配置することです。関与する酵素は、電気活性反応物の消費または電気活性物質の生成を伴う反応を触媒しなければなりません。その後、消費または生成プロセスを監視し、分析物濃度を直接測定します。L-乳酸バイオセンサーの製造において、最も一般的に使用される生物認識要素はL-乳酸脱水素酵素（LDH）とL-乳酸オキシダーゼ（LOD）です。L-LODは、溶解した酸素の存在下でL-乳酸をピルビン酸に酸化し、水素過酸化物を生成します。これは電気化学的に活性であり、L-乳酸濃度に比例して還元または酸化されるため、バイオセンサーに使用できます。

図3. L-乳酸オキシダーゼバイオセンサーの基本原理。（Rathee K. 2015）

参考文献