乳酸オキシダーゼ

乳酸オキシダーゼ（Lox、EC 1.1.3.2）は、α-ヒドロキシ酸の酸化を触媒するホモ四量体のフラボタンパク質である。本酵素の系統名は（S）-乳酸：酸素 2-オキシドレダクターゼ（脱炭酸）である。一般に用いられる別名として、乳酸酸化的脱炭酸酵素、乳酸オキシダーゼ、乳酸オキシゲナーゼ、ラクテートオキシゲナーゼ、ラクチックオキシダーゼ、L-乳酸モノオキシゲナーゼ、ラクテートモノオキシゲナーゼ、L-乳酸-2-モノオキシゲナーゼが挙げられる。L-乳酸オキシダーゼは、グリコール酸オキシダーゼ、L-乳酸オキシダーゼ、L-乳酸モノオキシゲナーゼ、フラボシトクロム b₂、長鎖α-ヒドロキシ酸オキシダーゼ、およびL-マンデル酸デヒドロゲナーゼから構成されるFMN含有酵素ファミリーの新規メンバーである。

構造

FMN酵素の結晶構造では、補因子のイソアロキサジン環系はほぼ常に屈曲した、したがって還元型の形態で存在するが、チオレドキシンの構造では酸化型および還元型の両方が観察される。還元型補因子は、イソアロキサジン環系のC4位におけるペルオキソ付加体により再生される。関連する4種の酵素、すなわちグリコール酸オキシダーゼ（GLO）、可溶性キメラ型マンデル酸オキシダーゼ（MDH）、長鎖ヒドロキシ酸オキシダーゼ（HAO）、およびフラボシトクロム b₂（B2）の構造は、X線結晶構造解析により決定されている。これらの構造では、各モノマーは典型的な8本鎖のα/βバレルを有し、FMN補因子および基質の結合部位はβバレルのC末端側に位置する。GLOおよびHAOでは、生物学的に活性なユニットは、わずかに回転して積層した2つの四量体から構成される。MDHの活性ユニットは四量体を含むが、B2ではFMN結合部位および基質結合部位を有する2つのα/βバレルからなるヘテロ二量体である。B2は反応機構解明の研究対象として用いられてきたが、一方の鎖が電子移動に関与するヘムユニットも含むため、補因子再生が別経路で進行し、他の化合物とはやや異なる。

乳酸オキシダーゼ（LOX）の非対称単位には、密にパッキングした2つの四量体が含まれる。各四量体は生物学的に活性なユニットを形成し、グリコール酸オキシダーゼに類似した内部422対称性を有する。各LOX四量体の大きさは約50×100×100 Åであり、C末端は折りたたまれて中央のポアを充填する。各LOXモノマーは互いに良好に重ね合わせ可能で、二乗平均平方根（r.m.s.）偏差は0.19～0.69 Åの範囲である。最も類似するのはCとFであり、最も相違が大きいのはCとEである。以下の議論はLOXのモノマーAに基づく。LOX四量体を、結晶学的に生成したGLO四量体に重ね合わせると、1268個のC^α原子に対してr.m.s.偏差は1.24 Åであった。各LOXサブユニットの374アミノ酸は、バレル底部に2本の短いβストランドを有するα/βバレルに折りたたまれている。1つのモノマーにはサイズの異なる15本のαヘリックスが含まれる。FMN結合部位および活性部位はβバレルのC末端側に位置し、LOXの残基190～220は活性部位の蓋状構造を形成する。この領域は配列アラインメントにおいて保存性が低く、GLO、HAOおよびB2の構造では無秩序（ディスオーダー）である。

図1．非対称単位の半分を示すL-乳酸オキシダーゼ四量体。（Leiros I. 2006）

図2．L-乳酸オキシダーゼ四量体のモノマー構造。（Leiros I. 2006）

触媒機構

乳酸オキシダーゼはFMN依存性酵素の一つであり、FMN補因子の2電子還元を介してα-ヒドロキシ酸をα-ケト酸へ変換する反応を触媒する。本機構の詳細についてはなお議論が続いているが、最終的には還元型補因子から分子状酸素へ2電子および2プロトンが移動し、過酸化水素とα-ケト酸が生成され、最終的に補因子は酸化型へ戻る。反応は、還元および酸化の段階が連続するピンポン機構で進行する。第一段階では、隣接する塩基により基質のα炭素からプロトンが引き抜かれてカルバニオンが生成し、その後2電子が補因子へ移動する。

応用

乳酸濃度は、患者の健康状態評価および疾患研究における臨床診断の重要なパラメータとして広く用いられており、手術、スポーツ医学、ショック／外傷、ならびに食品産業における連続モニタリングにも利用されている。乳酸の定量に最も一般的に用いられる分析法には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、蛍光法、比色法、化学発光法、磁気共鳴分光法が含まれる。これらの方法は結果を得られる一方で、試料前処理に時間を要すること、また高価な装置および訓練された要員を必要とするためコストが高いことなどの欠点がある。しかし、バイオセンサーはこれらの制約を克服し得る。乳酸検出に利用可能な各種手法と比較して、バイオセンシング法は、（必要に応じて試料希釈を要する場合はあるものの）試料前処理を不要とし、簡便性、直接性、リアルタイム性を有するとともに、迅速応答と高い特異性、経済性および効率性を兼ね備える利点がある。酵素結合型バイオセンサー電極の概念は、電極表面近傍に酵素を配置することである。関与する酵素は、電気化学的に活性な反応物の消費または電気化学的に活性な物質の生成を伴う反応を触媒する必要がある。次いで、その消費または生成過程をモニタリングし、分析対象物の濃度を直接測定する。L-乳酸バイオセンサーの製造において最も一般的に用いられる生体認識素子は、L-乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）およびL-乳酸オキシダーゼ（LOD）である。L-LODは、溶存酸素存在下でL-乳酸をピルビン酸へ酸化し、電気化学的に活性な過酸化水素を生成する。過酸化水素は還元または酸化され得て、L-乳酸濃度に比例した信号を与えるため、バイオセンサーに利用できる。

図3．L-乳酸オキシダーゼ・バイオセンサーの基本原理。（Rathee K. 2015）

参考文献