DFP加水分解酵素

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序論

ヤリイカ Loligo vulgaris 由来のジイソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase；EC 3.1.8.2）は、314アミノ酸からなる35 kDaのタンパク質である。本酵素はCa²⁺依存性の有効なホスホトリエステラーゼであり、不可逆的アセチルコリンエステラーゼ（AChE）阻害剤として作用する一連の有機リン化合物を加水分解できる。基質にはジイソプロピルフルオロリン酸（DFP）ならびに、サリン（GB）、タブン（GA）等の高毒性G系列有機リン（OP）神経剤が含まれる。

図1．DFPase基質であるDFP、GB、GF、GDおよびGAの構造。立体中心はアスタリスクで示す（Chen, J.C.; et al. 2010）

DFPaseが触媒する加水分解反応では、リン酸またはホスホン酸とフッ化物イオンが生成し、有機リン剤の解毒が達成される。本酵素は大量発現が可能であり、有機溶媒に対する高い耐性と強固な安定性を示すことから、酵素的除染の有望な候補と考えられている。初めて得られたDFPase構造において活性部位近傍に観察されたHis287は、反応における一般塩基であると推定された。しかし、その後のHis287の変異実験では、脂肪族残基（例：ロイシン）に置換しても酵素全体の活性はほとんど変化しないことが示された。以降の一連の研究では、活性部位残基の変異体解析、同位体標識、ならびにDFPaseの2.2 Å中性子構造解析などを通じてDFPaseの機能および反応機構が検討された。その結果、Asp229による直接的な求核攻撃とホスホ酵素中間体の形成を含む反応機構が提案された。

図2．DFPaseにおける想定反応機構（Chen, J.C.; et al. 2010）

構造および活性部位環境

DFPaseの構造は多数報告されている。ホロ酵素に加え、複数の活性部位変異体の構造、ならびに設計基質アナログDcPPAとの複合体構造も解明されている。全体構造から、本タンパク質は中央の水トンネルを取り囲む6枚羽根のβプロペラ構造を採用し、2個のカルシウムイオンを配位していることが分かる。中央水トンネル内に位置する高親和性カルシウムCa1は構造完全性の維持に必須であり、His274側鎖による稀なCa–N配位を示す。低親和性カルシウムイオンCa2は活性部位ポケット底部に位置し、酵素の触媒活性に必須である。カルシウムイオンはさらに、中央水トンネルに連結した2分子の水および活性部位ポケット内の溶媒分子（W33）によって、活性部位直下で追加的に配位されている。

触媒カルシウムの配位残基については広範な変異導入が行われており、これら配位残基の変化は結合能および活性に重大な影響を及ぼす。作製された10種の変異体のうち、N175DおよびN120DのみがDFPに対して極めて弱い酵素活性を示し、残り8種は不活性であった。活性部位に負電荷が1つしか残存しない場合、これら変異体の不活性は触媒カルシウムの喪失に起因すると考えられる。Glu21はカルシウム配位において重要な役割を担うとみられ、Glu21が変異すると、近傍にどれほど負電荷が存在してもカルシウム結合能が失われる。

図3．DFPaseのフォールドおよび触媒カルシウム環境（Chen, J.C.; et al. 2010）

DFPaseの再設計

DFPaseの中性子構造解析および同位体標識研究は、Asp229が基質のP原子へ求核攻撃し、ホスホ酵素中間体の形成とそれに続く加水分解に至ることを支持している。これらの情報は、酵素の総合活性および解毒特性を改善するための合理的設計において重要な役割を果たし得る。さらにDFPaseの構造は活性部位環境の剛直性を示しており、基質アナログDcPPAとの共結晶構造では結合後も活性部位にほとんどコンフォメーション変化が認められないことから、DFPaseはロック＆キー型酵素の一例である。野生型DFPaseは、G系列神経剤のうち毒性の低い立体異性体を優先的に結合・加水分解する。これらの再設計に向けて、シクロサリンのR_PおよびS_P立体異性体についてホスファターゼ中間体モデルが作製された。より毒性の高いR_P立体異性体を受容できるよう、活性部位が改変された。残基37、144および146に短い側鎖を導入することで活性部位の一方の側により開いた結合ポケットを形成し、反対側の面では残基195により大きな側鎖を導入して制限を加えた。得られた2種の変異体はE37A/Y144A/R146A/T195MおよびE37D/Y144A/R146A/T195Mである。これら2種の変異体について活性評価が行われ、X線構造解析も実施された。いずれも、シクロサリン（GF）およびサリン（GB）のラセミ混合物に対して全体的な活性増強を示した。野生型DFPaseと比較して、変異体E37A/Y144A/R146A/T195Mのシクロサリン（GF）S_P立体異性体に対する立体選択性は約200倍高い。これら変異体はDFP、GFおよびGBに対して比活性が高く、S_P立体異性体の迅速な加水分解により、解毒特性が有意に向上している。