DFPase

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はじめに

イソプロピルフルオロホスファターゼ（DFPase; EC 3.1.8.2）は、イカ Loligo vulgaris から得られる35 kDaのタンパク質で、314のアミノ酸から構成されています。これは、不可逆的なアセチルコリンエステラーゼ（AChE）阻害剤である一連の有機リン化合物を加水分解できる効果的なCa²⁺依存性ホスホトリエステラーゼです。その基質には、イソプロピルフルオロホスフェート（DFP）や、サリン（GB）、タブン（GA）などの高毒性G型有機リン（OP）神経剤が含まれます。

図1. DFPase基質DFP、GB、GF、GD、GAの構造。立体中心はアスタリスクで示されています（Chen, J.C.; et al. 2010）

DFPaseによって触媒される加水分解反応は、リン酸またはホスホネートとフッ化物イオンを生成し、有機リン剤を解毒します。この酵素は大量に発現でき、有機溶媒に対して高い耐性を示し、強い安定性を持つため、酵素的除染の有望な候補と考えられています。DFPase構造で初めて観察された活性部位近くのHis287は、反応における一般的な塩基であると推定されています。しかし、その後のHis287に関する変異実験では、アルキル残基（ロイシンなど）に置き換えられても、酵素の全体的な活性はほとんど変わらないことが示されました。その後の一連の研究では、活性部位残基の変異体、同位体標識、DFPaseの2.2 Å中性子構造を含むDFPaseメカニズムの機能と構造が研究されました。これにより、Asp229による直接的な求核攻撃とホスホ酵素中間体を含む反応メカニズムが提案されました。

図2. DFPaseの潜在的な反応メカニズム（Chen, J.C.; et al. 2010）

構造と活性部位環境

多くのDFPase構造が報告されています。ホロ酵素に加えて、活性部位変異体のいくつかの構造や、設計された基質類似体DcPPAとの複合体の構造も解明されています。全体の構造から、タンパク質は中央の水トンネルを囲む6枚のブレードのβプロペラを採用し、2つのカルシウムイオンを配位していることがわかります。中央の水トンネルに位置する高親和性カルシウムCa1は、構造の完全性を維持するために必要であり、His274の側鎖による稀なCa-N配位を示します。低親和性カルシウムイオンCa2は、活性部位ポケットの底に位置し、酵素の触媒活性に不可欠です。カルシウムイオンは、中央の水トンネルにリンクされた2つの水分子と、活性部位ポケット内の溶媒分子（W33）によって、活性部位の下でさらに配位されています。

触媒カルシウム配位残基は広範な変異を受けており、これらのカルシウム配位残基の変化は結合と活性に重要な影響を与えます。作成された10の変異体の中で、N175DとN120DだけがDFPに対して非常に弱い酵素活性を示し、残りの8つの変異体は不活性でした。活性部位に負の電荷が1つだけ残っている場合、これらの変異体の不活性は触媒カルシウムの喪失に起因すると考えられます。Glu21はカルシウム配位に重要な役割を果たしているようで、Glu21が変異すると、近くにどれだけの負の電荷があっても、カルシウム結合機能の喪失を引き起こします。

図3. DFPaseの折りたたみと触媒カルシウム環境（Chen, J.C.; et al. 2010）

DFPaseの再設計

DFPaseの中性子構造と同位体標識研究は、Asp229による基質のP原子への求核攻撃を支持し、ホスホ酵素中間体の形成とその後の加水分解を引き起こします。この情報は、酵素の全体的な活性と解毒特性を改善するための合理的な設計に重要な役割を果たすことができます。さらに、DFPaseの構造は活性部位環境の剛性を強調しており、基質類似体DcPPAとの共結晶構造は、結合後に活性部位にほとんど構造変化がないことを示しており、DFPaseはロックアンドキー酵素の一例となっています。野生型DFPaseは、G型神経剤の毒性の低い立体異性体を優先的に結合し、加水分解します。これらの再設計のために、サイコサリンのR_PおよびS_P立体異性体のためのホスファターゼ中間体モデルが生成されました。活性部位は、より毒性の高いR_P立体異性体に対応するように修正されました。残基37、144、146に短い側鎖を導入することで、活性部位の一方の側により開いた結合ポケットが作成され、反対側は残基195に大きな側鎖を導入することで制限されます。得られた2つの変異体はE37A/Y144A/R146A/T195MおよびE37D/Y144A/R146A/T195Mです。これらの2つの変異体の活性がテストされ、X線構造も分析されました。両者は、サイコサリン（GF）およびサリン（GB）のラセミ混合物に対して全体的に活性が向上しました。野生型DFPaseと比較して、変異体E37A/Y144A/R146A/T195Mのサイコサリン（GF）のS_P立体異性体に対する立体選択性はほぼ200倍高いです。変異体はDFP、GF、GBに対してより高い特異的活性を持ち、SP立体異性体の迅速な加水分解により、解毒特性が大幅に向上します。