AST

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（EC 2.6.1.1；AspAT）は、ピリドキサール-5′-リン酸（PLP）依存性酵素であり、アスパラギン酸と2-オキソグルタル酸との間の可逆的なアミノ基転移反応を触媒して、オキサロ酢酸およびグルタミン酸を生成する。AspATは植物、微生物および動物に広く存在し、細胞内の窒素・炭素代謝過程において極めて重要な役割を担う。また、尿素生成（ウレアジェネシス）にも関与し、アスパラギン酸／リンゴ酸シャトルを介して還元当量をミトコンドリアへ移送する過程にも関与する。主として酸性アミノ酸とケト酸との間の可逆反応を担う。アミノ基の転移は、補酵素がピリドキサールリン酸とピリドキサミンリン酸の間で相互変換されることにより達成される。バイオテクノロジーの進展に伴い、分子シミュレーション等の手法を用いて構造レベルから触媒機構を解析する研究が増加し、酵素改変および合理的設計の指針が提示されている。

特性

1984年、Kondo KらはE. coliにおけるAspATの完全アミノ酸配列を報告し、鳥類および哺乳類との配列相同性を解析した結果、相同性は40%であることを示した。1987年には、E. coli AspATのアミノ酸配列をさらに解析し、E. coli AspATは396残基からなり、分子量は4.35 kDaであると結論付けた。さらに、AspATは非極性残基55.8%、極性残基44.2%を含み、ニワトリおよびブタのミトコンドリアに存在するアイソザイムと類似していることを見出した。配列相同性に基づき、AspATはトランスアミナーゼClass Iに分類される。AspATは配列相同性により7つのサブクラスに分類することもできる。他のAspATサブタイプや基質特異性の異なる他のトランスアミナーゼと比較して、Iα型AspATは広範かつ詳細に研究されている。

構造

初期には、AspATは部位特異的変異導入実験により構造推定が行われた。1986年、SmithらはX線回折法によりその三次元構造を決定した。E. coli AspATは同一の2サブユニットからなるホモ二量体であり、各サブユニットは大ドメインおよび小ドメインに分けられる。構造中の各部位の機能に基づき、各サブユニットは、N末端アーム（2サブユニット間の連結に用いられ、酵素全体の安定構造に寄与）、大ドメイン（補酵素結合に関与）、小ドメイン（サブユニット結合に関与）に区分される。酵素が基質に結合すると、小ドメインは大ドメイン側へ移動する。したがって、構造ドメイン間の界面組成は重要であり、これらの領域には一般に高度に保存された配列が存在する。S. pomeroyi由来の推定アミノトランスフェラーゼの構造をサーチモデルとして用いたところ、AspAT結晶は2.50 Åの分解能限界まで回折し（図1）、分子置換法により三次元構造が解かれた。自己回転関数の解析から、結晶の非対称単位に含まれる4分子は222の分子対称性を有するように見えることが示された。

図1．単一AspAT結晶から1.0の振動範囲で収集した代表的な回折像。
（Deepak Chandra Saroj, et al. 2014）

触媒機構

アスパラギン酸生合成は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の増殖および生存に必須の経路である。Mtb由来アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AspAT）の構造解析は、構造基盤型の低分子阻害剤設計のプラットフォームを提供するのみならず、その触媒の詳細機構の解明にも資する。生理条件下では、AspATはケトグルタル酸およびオキサロ酢酸をアミノ受容体として、またGluおよびAspをアミノ供与体として利用する。AspATは2種類の基質と異なる様式で相互作用し得る。反応過程で最も重要な補酵素はピリドキサール-5′-リン酸（PLP）であり、そのε-4炭素原子が酵素活性中心のリジン残基のアミノ基と共有結合してアルジミンを形成する。

図2．アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの反応機構。

AspATは同一の2サブユニットからなり、活性中心はサブユニット界面に位置する。活性中心残基は、異なるアイソザイム間で高度に保存されている。各サブユニットは、基質および補酵素の結合部位を有する。主要な原理は、正に帯電したアルギニン残基を介した基質のグアニジノ基と、基質のカルボキシル基との相互作用である。AspATでは、カルボキシル基は末端カルボキシル基と相互作用する。AspATは補酵素としてPIPを用い、シッフ塩基の形でリジン残基に共有結合していた。PLPとPMPの間で補酵素が相互変換されることにより、アミノ基転移反応が促進された。

参考文献