アラニンラセマーゼ

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アラニンラセマーゼ（Alr、L-アラニンラセマーゼとも呼ばれる）は、原核生物に広く存在する酵素である。本酵素は、アミノ酸およびその誘導体に作用する異性化酵素（イソメラーゼ）ファミリーに属し、アラニンおよびアスパラギン酸の代謝に関与する。アラニンラセマーゼはピリドキサール5′-リン酸（PLP）を補酵素として用い、L-アラニンのラセミ化を触媒して細胞壁合成に必要なD-アラニンを供給する。本酵素は細菌全般に分布するため、抗菌薬開発における魅力的な標的となるが、一部の細菌ではD-アラニン合成の代替経路が存在するため、これらの細菌に対してはアラニンラセマーゼが抗菌標的として機能しない。水生動物、真菌、植物などの真核生物では、類似酵素はほとんど見出されない。メタン生成古細菌であるMethanococcus maripaludisのゲノム配列から、アラニン脱水素酵素遺伝子がアラニンラセマーゼおよびアラニン透過酵素の遺伝子に隣接していることが示されている。AlrはD-アラニン利用における機能に加え、D-アラニンによる阻害から系を保護する可能性も示唆されており、D-アラニンとL-アラニンの混合物上でAlr変異株の増殖が低下したことが報告されている。近年の研究では、アラニンラセマーゼおよびDadXホモログをコードする遺伝子を欠くChlamydia pneumoniaeにおいて、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼGlyAがD-アラニン供給源として利用され得ることが示されている。

アラニンラセマーゼの構造

Alrおよび阻害剤複合体について、多数の結晶構造が解明されている。最も詳細に研究されている構造の一つとして、Geobacillus stearothermophilus由来Alr（PDB ID: 1SFT）があり、2つのモノマーが頭尾（head-to-tail）様式で会合して形成される、388残基からなるホモ二量体酵素であることが示されている。各モノマーは2つの折りたたみドメインから構成される：(i) 1–240残基からなるN末端ドメイン、(ii) 241–388残基からなるC末端ドメイン。

N末端ドメインは8本鎖のα/βバレルから構成され、C末端ドメインはβストランドのみから構成される。分子動力学研究により、Alrホモ二量体の2つの活性部位に水分子が存在することが示されている。この水分子は重要な役割を担うため、阻害剤設計において十分に考慮すべきである。Alrの各モノマーの活性部位には、Lys39に共有結合したPLP結合残基に加え、ピリドキサール補因子近傍のアミノ酸残基が含まれる。Lys39はα/βバレルの第1β鎖のC末端に位置し、その側鎖はバレル中心に向く。各モノマーの触媒ドメイン同士の傾斜角は125°である。したがって、Lys39残基はモノマーの2ドメインが形成するクレフトにも伸長し、PLP部分はバレルのおおよその中心に位置しつつ、もう一方のモノマーの第2ドメイン側により近接して配置される。 

図1．Bacillus stearothermophilus Alrホモ二量体の模式図（PDB ID: 1SFT）（Azam, M.A.; Jayaram, U. 2016）

アラニンラセマーゼ阻害剤

Alr酵素阻害剤の探索は、1966年にLynchおよびNeuhausがStreptococcus faecalisにおけるO-カルバモイル-D-セリンの作用機序を説明したことに始まる。この研究では、O-カルバモイル-D-セリンが有効なAlr阻害剤であることが見出され、酵素反応速度論的研究により裏付けられた。研究の焦点は、O-カルバモイル-D-セリンのAlrに対する主要作用部位を確立し、D-Ala-D-Ala合成酵素、D-Ala-D-Ala付加酵素、ならびにホスホ-N-アセチルムラミル-ペンタペプチドトランスロカーゼなど他の作用部位と比較することに置かれた。

また、200 μg/mLのD-異性体はStreptococcus lactis、Lactobacillus arabinosus、およびE. coliに影響を与えないことが観察され、これらの結果はNeuhausおよびLambertが1972年に報告した内容と一致する。さらに、L-シクロセリンが有効な競合阻害剤であることも証明され、従来、L-シクロセリンはStaphylococcus aureusのAlr阻害には無効と考えられていた。AthertonらはL-アラニン類縁体であるアラホスファリン（Alafosfalin）を合成し、グラム陽性菌およびグラム陰性菌の双方においてペプチドグリカン生合成の選択的阻害剤であることが見出された。アラホスファリンは、グラム陽性菌において二リン酸-N-アセチルムラミル-トリペプチドの蓄積を増加させ、細胞内D-アラニン濃度を低下させる。細菌では、アラホスファリンは立体特異的ペプチド透過酵素により取り込まれ、最終的に細胞内アミノペプチダーゼにより1-アミノエチルホスホン酸へ加水分解される。1-アミノエチルホスホン酸の標的部位はAlr酵素であり、グラム陰性のE. coliでは可逆的かつ競合的に阻害され、Staphylococcus aureusやStaphylococcus faecalisなどのグラム陽性菌では時間依存的に不可逆阻害を示す。

図2．Alr阻害剤O-カルバモイル-D-セリンおよびアラホスファリンの構造（Azam, M.A.; Jayaram, U. 2016）