アラニンラセマーゼ

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アラニンラセマーゼ（Alr）、またはL-アラニンラセマーゼとしても知られるこの酵素は、広く存在する原核生物の酵素です。この酵素は、アミノ酸およびその誘導体に作用する異性化酵素のファミリーに属し、アラニンおよびアスパラギン酸の代謝に関与しています。アラニンラセマーゼは、ピリドキサール5'-リン酸（PLP）を利用してL-アラニンのラセミ化を行い、細胞壁合成のためのD-アラニンを供給します。この酵素は細菌全体に存在するため、アラニンラセマーゼは抗菌薬開発の魅力的なターゲットですが、一部の細菌ではD-アラニン合成のための代替経路があるため、これらの細菌に対してアラニンラセマーゼは抗菌ターゲットとして機能しません。水生動物、真菌、植物などの真核生物では、類似の酵素はほとんど見つかりません。メタン生成古細菌のゲノム配列、Methanococcus maripaludisは、アラニン脱水素酵素遺伝子がアラニンラセマーゼおよびアラニン透過酵素の隣に位置していることを示しています。D-アラニンの利用における機能に加えて、AlrはD-アラニンの抑制からシステムを保護することもできます。なぜなら、DおよびL-アラニンの混合物上でのAlr変異体の成長が妨げられたからです。最近の研究では、アラニンラセマーゼおよびDadXホモログを欠くChlamydia pneumoniaeにおいて、セリンヒドロキシメチル転移酵素GlyAがD-アラニンの供給源として利用できることが示されています。

アラニンラセマーゼの構造

Alrおよび阻害剤複合体の多くの結晶構造が解明されています。最もよく研究された構造の一つは、Geobacillus stearothermophilusからのAlr（PDB ID: 1SFT）で、これは二つのモノマーの頭尾結合によって形成された388残基のホモ二量体酵素を明らかにしています。各モノマーは、（i）1-240aaで形成されたN末端ドメインと、（ii）241-388aaで形成されたC末端ドメインの二つの折りたたまれたドメインから構成されています。

N末端ドメインは八本のストランドからなるα/β-バレルで構成され、C末端ドメインはβストランドのみで構成されています。分子動力学研究により、Alrホモ二量体の二つの活性部位に水分子が存在することが示されています。この水分子は重要な役割を果たすため、阻害剤の設計時には十分に考慮されるべきです。Alrの各モノマーの活性部位には、Lys39に共有結合したピリドキサール5'-リン酸（PLP）結合残基と、ピリドキサール補因子の近傍にあるアミノ酸が含まれています。Lys39はα/β-バレルの最初のβ鎖のC末端に位置し、その側鎖はバレルの中心を指しています。各モノマーの触媒ドメインが互いに傾いている角度は125°です。したがって、Lys39残基はモノマーの二つのドメインによって形成された裂け目にも伸びており、PLP部分はバレルのほぼ中心に位置し、他のモノマーの第二ドメインに近づいています。 

図1. Bacillus stearothermophilus Alrホモ二量体の図示ビュー（PBD ID: 1SFT）（Azam, M.A.; Jayaram, U. 2016）

アラニンラセマーゼの阻害剤

Alr酵素阻害剤の探索は、1966年にLynchとNeuhausがStreptococcus faecalisにおけるO-カルバモイル-D-セリンの作用機序を説明したときに始まりました。この研究では、O-カルバモイル-D-セリンが効果的なAlr阻害剤であることが発見され、酵素動力学研究によって支持されました。研究の焦点は、O-カルバモイル-D-セリンのAlrに対する主要な作用部位を確立することであり、D-ala-D-ala合成酵素、D-ala-D-ala付加酵素、リン酸化NAc-ムラミル-ペンタペプチド転送酵素などの他の作用部位と比較されました。

また、200 μg/mLのD-異性体がStreptococcus lactis、Lactobacillus arabinosus、およびE. coliに影響を与えなかったことも観察され、これらの結果は1972年にNeuhausとLambertによって報告されたものと一致しています。彼らはまた、L-シクロセリンが効果的な競争的阻害剤であることを証明しましたが、以前はL-シクロセリンはStaphylococcus aureusのAlrの阻害には効果がないと考えられていました。Atherton et al.は、L-アラニン類似体であるアラフォスファリンを合成し、これはグラム陽性およびグラム陰性細菌のペプチドグリカン生合成の選択的阻害剤であることがわかりました。これは、グラム陽性生物における二リン酸-N-アセチル-ムラミル-トリペプチドの蓄積を増加させ、D-アラニンの細胞内レベルを減少させます。細菌では、アラフォスファリンは立体特異的ペプチド透過酵素によって輸送され、最終的に細胞内アミノペプチダーゼによって1-アミノエチルホスホン酸に加水分解されます。1-アミノエチルホスホン酸の標的部位はAlr酵素であり、これはグラム陰性のE. coliで可逆的かつ競争的に阻害され、グラム陽性のStaphylococcus aureusやStaphylococcus faecalisでは時間依存的に不可逆的に阻害します。

図2. Alr阻害剤O-カルバモイル-D-セリンおよびアラフォスファリンの構造（Azam, M.A.; Jayaram, U. 2016）