mRNAベースのワクチンおよび治療薬の登場は、COVID-19ワクチンの迅速な開発に代表されるように、現代医療に革命をもたらしました。従来型のバイオ医薬品とは異なり、mRNAは関心のあるほぼあらゆるタンパク質をコード可能な、柔軟かつ迅速な製造プラットフォームを提供します。しかし、高品質なmRNAの製造には、有効性、安定性および安全性を担保するため、製造工程の各ステップに対する厳格な管理が求められます。

Creative Enzymesでは、T7 RNAポリメラーゼ、RNase阻害剤、DNase I、ワクシニアキャッピング酵素など、mRNA製造に用いる各種酵素を提供しています。本稿では、mRNA製造プロセスを体系的に概説し、収量、純度および機能性に影響する重要パラメータに焦点を当てます。

図1. 直鎖化したDNAプラスミドテンプレートからmRNAを作製するin vitro転写のプロセス。（Knezevic et al., 2021）

DNAテンプレートの調製

合成mRNA製造のための効率的なin vitro転写（IVT）は、通常、設計改変したプラスミドとして用意されるDNAテンプレートを精緻に調製することから始まります。このテンプレートは転写の設計図として機能し、得られるmRNA製品の忠実性、安定性および翻訳効率に直接影響します。

プラスミドの設計およびエンジニアリング

DNAテンプレートとして用いるプラスミドは、転写効率および下流の翻訳活性を最適化するよう設計された合成コンストラクトです。典型的なmRNAコードプラスミドは、以下の主要要素から構成されます。

• プロモーター配列：DNA依存性RNAポリメラーゼの結合部位であり、通常はT7、SP6、T3などのバクテリオファージ由来です。プロモーターは高収量のin vitro転写を駆動し、多くの場合、5'非翻訳領域（UTR）の直上流に配置されます。
• 5'非翻訳領域（5' UTR）：リボソームリクルートを最適化するよう設計され、翻訳効率を高めます。Kozakコンセンサス配列や、リボソームスキャニングを促進するための二次構造の最小化などが重要な特徴です。
• オープンリーディングフレーム（ORF）：目的タンパク質をコードする配列です。標的宿主の翻訳機構に合わせたコドン最適化により、翻訳効率の向上および潜在的な免疫原性の低減を図ります。
• 3'非翻訳領域（3' UTR）：mRNAの安定性および翻訳制御を調節する配列要素を含みます。一般的な安定化モチーフとして、ヒトβグロビンまたはαグロビン遺伝子由来の配列が用いられます。
• ポリアデニル化シグナルおよびpoly(A)テール：プラスミドにコードするか、転写後に付加します。3'末端に70～120残基のアデノシンを付加することで、真核生物の天然転写産物を模倣し、mRNAの安定性および翻訳効率を向上させます。

設計上の重要検討事項：

• コドン最適化：標的発現系で好まれる同義コドンに希少コドンを置換することで、アミノ酸配列を変えずに翻訳効率を高めます。
• 免疫原性モチーフの回避：非メチル化CpGアイランド、poly(U)配列、その他の病原体関連分子パターン（PAMP）を含む配列は自然免疫応答を誘導し得ます。配列設計において、これらを最小化または除去します。

プラスミドの増幅および精製

設計後、改変プラスミドは転写反応に使用するため、スケールアップして増幅・精製する必要があります。

• 細菌増幅：形質転換によりプラスミドを高コピー数のEscherichia coli株（例：DH5α）へ導入します。プラスミド保持を確実にするため、選択抗生物質（アンピシリン、カナマイシン等）存在下で培養します。
• プラスミド精製：培養菌体を回収し、アルカリ溶解法による抽出後、精製工程を実施します。市販のシリカカラムベースキットが広く使用されます。超高純度DNAが必要な研究（例：治療用グレードmRNA）では、塩化セシウム（CsCl）密度勾配超遠心法が用いられる場合があります。

品質管理（QC）項目：

• アガロースゲル電気泳動：プラスミドの完全性および、転写能が最も高いスーパーコイル体の優勢を確認します。
• 分光光度法（A260/A280およびA260/A230比）：DNA濃度および純度を評価します。一般に許容される純度比は、A260/A280で約1.8、A260/A230で2.0超です。

プラスミドDNAの直鎖化

リードスルー転写を防止し、均一なmRNA転写産物を得るため、IVT前にプラスミドDNAを直鎖化する必要があります。

• 制限酵素消化：poly(A)テール下流のユニークな制限部位を、BspQI、ApaI、NotIなどの酵素で切断します。酵素選択はプラスミド設計および望ましい末端構造に依存します。
• 末端特性：望ましくない転写アーチファクトを防ぐため、3'突出末端を生じる酵素よりも、平滑末端または5'突出末端を生じる酵素が推奨されます。
• テンプレート精製：消化後、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿、またはカラム精製（例：シリカスピンカラム）により、酵素および小断片を除去します。最終テンプレートは高純度でRNaseフリー、かつ未消化プラスミドを含まないことが求められます。

In Vitro転写（IVT）

IVTは、ファージ由来RNAポリメラーゼを用いて直鎖DNAテンプレートを鋳型にin vitroでmRNAを合成する工程です。機能性タンパク質発現から治療用RNA製造まで、用途を問わず高収量・高忠実度のmRNA合成が重要です。

反応構成要素

標準的なIVT反応には以下が含まれます。

• RNAポリメラーゼ：テンプレート上のプロモーターに対応して、T7、SP6、またはT3 RNAポリメラーゼを使用します。T7ポリメラーゼは転写効率が高いため最も一般的です。
• ヌクレオチド三リン酸（NTP）：ATP、GTP、CTP、UTPを等モル濃度（通常4～8 mM）で用い、RNA合成の基質とします。
• 反応バッファー：マグネシウムイオン（Mg²⁺）などの必須補因子、酸化還元状態を維持するジチオスレイトール（DTT）、核酸を安定化するスペルミジン等を含みます。
• RNase阻害剤：転写中に新生RNAが分解されるのを防ぐため、RNase阻害剤を添加します。

図2. Saccharomyces cerevisiae RNAP II CTD。（Pal, 2020）

IVT条件の最適化

• NTP濃度：NTPが過剰に高いと早期終結や短鎖転写産物の増加につながる一方、不足すると収量が制限されます。約4～8 mMのバランスが最適です。
• マグネシウムイオン濃度：Mg²⁺はポリメラーゼ活性および忠実性に必須です。最適濃度は20～30 mMで、テンプレートやスケールに応じて滴定が必要となる場合があります。
• インキュベーション条件：標準的には37°Cで2～4時間反応させます。反応時間の延長は収量増加に寄与し得ますが、RNA分解や不純物生成リスクも増大します。

共転写修飾

合成mRNAの翻訳性能を向上させ、免疫原性を低減するため、転写中に複数の修飾を直接導入できます。

5'キャッピング戦略：

• Cap 0（m⁷GpppG）：真核mRNAキャップの最も単純な形態です。取り込み効率を高めるため、GTPに対してモル過剰で添加されることが一般的です。
• ARCA（Anti-Reverse Cap Analog）：逆向きキャップの取り込みを防ぎ、5'末端の正しい配向を担保することで、リボソーム認識を向上させます。

ヌクレオチド修飾：

• シュードウリジン（Ψ）およびN1-メチルシュードウリジン（m¹Ψ）：自然免疫（例：TLR7/8）による認識を低減し、翻訳効率を向上させます。
• 5-メチルシチジン（m⁵C）：ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を高めてmRNA安定性を改善し、翻訳最適化にも寄与します。
• その他の修飾（例：2-チオウリジン、N6-メチルアデノシン）も、薬物動態の改善および炎症性シグナルの低減を目的として、治療用mRNA設計において検討が進められています。

転写後プロセシング

in vitro転写（IVT）後、得られたRNAは、成熟した安定かつ翻訳可能なメッセンジャーRNA（mRNA）とするために、一連の転写後修飾および精製工程を経る必要があります。これらの工程により、合成転写産物は構造および機能の両面で天然の真核mRNAを模倣し、タンパク質発現やmRNA医薬などの下流用途における有効性を最大化します。

酵素的キャッピング（共転写で実施しない場合）

共転写キャッピングやAnti-Reverse Cap Analog（ARCA）の使用が近年は優先される傾向にある一方、酵素的キャッピングは堅牢な代替手段として依然有用であり、特にキャッピング効率および忠実性を精密に制御する必要がある研究用グレードおよび治療用グレードmRNA製造で重要です。

• ワクシニアキャッピング酵素（VCE）：多機能酵素複合体であり、Cap 0（m⁷GpppN）として知られる5'キャップ構造を段階的に酵素反応で付加します。ここで「m⁷G」は、最初に転写されたヌクレオチドに対し5'–5'三リン酸結合で連結した7-メチルグアノシンを示します。VCEはRNAトリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、（グアニン-N7）メチルトランスフェラーゼ活性を担います。キャップは転写産物の安定性、翻訳開始の効率化、エキソヌクレアーゼ分解に対する抵抗性において重要な役割を果たします。
• 2'-O-メチルトランスフェラーゼ：最初に転写されたヌクレオチドのリボース2'-水酸基をメチル化し、Cap 0をCap 1（m⁷GpppNm）へ変換します。Cap 1構造は宿主免疫系により「自己」として認識され、Toll様受容体（TLR）、RIG-I、MDA5を介した自然免疫応答を有意に低減します。

酵素的キャッピング法は、非キャップRNAを完全キャップ化されたCap 1構造へほぼ定量的に変換でき、ワクチン開発や遺伝子補充療法などの高感度用途において特に有用です。

図3. RNA 5'末端キャップ形成に至る逐次的酵素活性。（Pal, 2020）

Poly(A)テーリング

プラスミドDNA内にポリアデニル化配列がコードされていない場合、3' poly(A)テールは転写後に酵素的に付加する必要があります。

• Poly(A)ポリメラーゼ（PAP）：RNA転写産物の3'水酸基末端に対し、鋳型非依存的にアデノシン一リン酸を付加します。本反応は通常ATPを基質として用い、テール長の均一性および適正化を担保するため最適化バッファー系で実施します。
• 最適poly(A)テール長：経験的研究から、約100～150ヌクレオチドのpoly(A)テールが、転写産物の安定性、翻訳効率および細胞質分解抵抗性のバランスに最適であることが示唆されています。過度の伸長は折りたたみや翻訳に影響し得る一方、短すぎるテールは安定性を損ないます。

ポリアデニル化は、真核細胞におけるmRNA半減期およびリボソーム複合体へのリクルートに関する重要な決定因子です。

DNase処理

IVT反応に残存するDNAテンプレートは、規制ガイドラインへの適合、自然免疫活性化の回避、および機能アッセイにおけるバックグラウンド低減のため、厳格に除去する必要があります。

• Turbo DNase（組換えRNaseフリーDNase I）：RNAの完全性を保持する条件下で、一本鎖および二本鎖DNAを効率的に加水分解します。通常、IVTおよびポリアデニル化後に実施し、その後、加熱失活または精製により酵素を除去します。

DNase処理は治療用途に限らず、DNA汚染が定量を攪乱し得るRT-qPCRなどの分析ワークフローにおいても不可欠です。

mRNA精製

精製は、治療用グレードmRNA製造において最も重要な工程の一つです。本工程では、タンパク質、残存DNA、短鎖転写産物、ヌクレオチド、酵素、エンドトキシンなどの不純物を除去します。要求される品質および規制要件を満たすため、複数の精製戦略を組み合わせて適用することが一般的です。

沈殿法

沈殿は、簡便性、スケーラビリティおよびコスト効率の観点から、一次精製法として広く用いられています。

• 塩化リチウム（LiCl）沈殿：LiClは長鎖RNAを選択的に沈殿させ、上清中に多くのタンパク質、短鎖RNA断片、遊離ヌクレオチドおよび塩類を残します。標準プロトコールでは4°Cでインキュベート後、高速遠心を行います。
• エタノール沈殿：塩（例：酢酸ナトリウム）と併用し、希薄溶液からRNAを効率的に回収します。本工程は、酵素処理やクロマトグラフィー精製前のバッファー交換および脱塩に特に有用です。

沈殿法は高分離能ではないものの、バルク不純物を低減するため、多段精製プロトコールに組み込まれることが多い手法です。

クロマトグラフィー精製

クロマトグラフィーは、全長で高純度のmRNA転写産物を分離・回収するうえで、優れた分離能と特異性を提供します。

• Oligo(dT)アフィニティクロマトグラフィー：poly(A)テールとoligo(dT)固定化樹脂（例：セファロース、磁気ビーズ）との親和性を利用します。ポリアデニル化転写産物を選択的に捕捉し、短鎖RNAや非ポリアデニル化汚染物を除去します。IVT混合物からmRNAを精製する際に特に有効です。
• サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）：分子の流体力学的半径に基づいて分離します。短鎖転写産物、分解RNA、未取り込みヌクレオチドを除去しつつ、全長mRNAの天然コンフォメーションを保持できます。
• イオン交換クロマトグラフィー（IEX）：正味電荷に基づいて核酸を分離します。低塩条件下で陰イオン交換樹脂（例：DEAE、Q-セファロース）が一般的に用いられます。塩濃度勾配を精密に調整することで、キャップ化／非キャップ化mRNA、全長／短鎖産物の分離が可能です。

クロマトグラフィーは、ロット間一貫性が求められる臨床用グレードmRNAの製造において特に有用です。

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）

HPLCは、mRNA精製における強力な分析・調製ツールであり、mRNAアイソフォーム、不純物、構造的に類似した分子種の分離を可能にします。

• 逆相HPLC（RP-HPLC）：RNAとカラム担体との疎水性相互作用に基づきます。通常C18カラムを用い、分離能向上のためイオンペア試薬（例：トリエチルアンモニウムアセテート）を使用します。RP-HPLCは、修飾／非修飾mRNA、短鎖産物、残存酵素タンパク質の分離に優れます。
• 疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）：疎水性の差に基づき、キャップ化／非キャップ化RNAの識別に有用です。HICは品質管理用途、または最終純度を高める二次精製工程として用いられることが多い手法です。

これらの手法は品質保証（QA）環境において有用であり、mRNA医薬のGMP製造プロセスに組み込まれることが少なくありません。

ろ過ベースの手法

タンジェンシャルフローろ過（TFF）は、バッファー交換、RNA濃縮および不純物除去のためのスケーラブルで効率的な手法です。TFFシステムは、所定の分子量カットオフを有する中空糸膜または平膜を使用し、RNAを保持しつつ低分子および塩類を透過させます。

TFFは、特に大規模mRNA製造において、上流・下流の両工程で頻用されます。連続生産戦略との親和性が高く、高スループット運用に適しています。

図4. 機能性mRNA製造の概要。（Papaioannou et al., 2023）

mRNA製造パイプラインは、DNAテンプレート調製、IVT、キャッピング、精製、および厳格な品質管理からなる、精密に管理されたプロセスです。酵素的修飾、クロマトグラフィー精製、分析技術の進展により、mRNAの収量、安定性および翻訳効率は大幅に向上しました。規制枠組みの進化と新規技術の登場に伴い、mRNA製造は今後も改善が進み、より幅広い治療応用が可能になると期待されます。

Creative Enzymesでは、プラスミド直鎖化、in vitro転写、キャッピング、ポリアデニル化を含むmRNA製造パイプラインの各工程で必要となる高性能酵素を提供しています。ご質問・ご相談は、ぜひお問い合わせください。