mRNAベースのワクチンおよび治療薬の登場は、COVID-19ワクチンの迅速な開発に代表されるように、現代医療に革命をもたらしました。従来のバイオ医薬品とは異なり、mRNAはほぼあらゆる目的のタンパク質をコードできる柔軟かつ迅速な生産プラットフォームを提供します。しかし、高品質なmRNAを製造するには、生産パイプラインの各工程を厳格に管理し、有効性、安定性、安全性を確保する必要があります。

Creative Enzymesでは、T7 RNAポリメラーゼ、RNaseインヒビター、DNase I、ワクシニアキャッピング酵素など、mRNA生産用の各種酵素を提供しています。ここでは、mRNA生産プロセスを体系的に紹介し、収量、純度、機能性に影響を与える重要なパラメータに焦点を当てます。

図1. 線状化されたDNAプラスミドテンプレートから作製されるmRNAのin vitro転写プロセス。（Knezevic et al., 2021）

DNAテンプレートの調製

合成mRNA生産のための効率的なin vitro転写（IVT）は、通常は設計されたプラスミドの形で、DNAテンプレートを綿密に調製することから始まります。このテンプレートは転写の設計図として機能し、生成されるmRNA製品の忠実性、安定性、翻訳効率に直接影響します。

プラスミド設計とエンジニアリング

DNAテンプレートとして使用されるプラスミドは、最適な転写および下流の翻訳活性を確保するために設計された合成構築体です。典型的なmRNAコードプラスミドは、以下のコア要素で構成されます。

• プロモーター配列：DNA依存性RNAポリメラーゼの結合部位であり、通常はT7、SP6、T3などのバクテリオファージ由来です。プロモーターは高収率のin vitro転写を駆動し、しばしば5'非翻訳領域（UTR）の直前に配置されます。
• 5'非翻訳領域（5' UTR）：リボソームのリクルートを最適化するよう設計されており、5' UTRは翻訳効率を高めます。主な特徴として、Kozakコンセンサス配列やリボソームスキャニングを促進するための最小限の二次構造が含まれます。
• オープンリーディングフレーム（ORF）：目的タンパク質のコード配列です。ターゲット宿主の翻訳機構に合わせたコドン最適化が施され、翻訳効率の向上や免疫原性の低減が図られます。
• 3'非翻訳領域（3' UTR）：3' UTRにはmRNAの安定性や翻訳制御を調節する配列要素が含まれます。一般的な安定性モチーフとしてはヒトβ-グロビンやα-グロビン遺伝子由来のものがあります。
• ポリアデニル化シグナルおよびpoly(A)テール：プラスミド内にコードされている場合や転写後に付加される場合があり、3'末端に70～120個のアデノシン残基が連なることで、天然の真核生物転写産物を模倣し、mRNAの安定性と翻訳効率を高めます。

主な設計上の考慮点：

• コドン最適化：希少コドンをターゲット発現系で好まれる同義コドンに置換することで、アミノ酸配列を変えずに翻訳効率を向上させます。
• 免疫原性モチーフの回避：非メチル化CpGアイランド、poly(U)配列、その他の病原体関連分子パターン（PAMPs）の存在は自然免疫応答を刺激する可能性があります。これらの配列は配列設計時に最小化または除去されます。

プラスミドの増幅と精製

設計後、エンジニアリングされたプラスミドは転写反応に使用するためにスケールアップして増幅・精製される必要があります。

• 細菌増幅：プラスミドは高コピー数株のEscherichia coli（例：DH5α）に形質転換により導入されます。培養は選択抗生物質（アンピシリン、カナマイシン等）存在下で行い、プラスミド保持を確実にします。
• プラスミド精製：細菌培養物を回収し、アルカリ溶解法でプラスミドを抽出した後、精製工程を行います。市販のシリカカラムベースのキットが広く使用されています。治療グレードmRNAなど超高純度DNAが必要な場合は、塩化セシウム（CsCl）密度勾配超遠心法が用いられることもあります。

品質管理手法：

• アガロースゲル電気泳動：プラスミドの完全性および超らせん型の優勢を確認します。超らせん型は最も転写能が高い形態です。
• 分光光度計測（A260/A280およびA260/A230比）：DNA濃度と純度を評価します。許容される純度比はA260/A280で約1.8、A260/A230で2.0以上が一般的です。

プラスミドDNAの線状化

IVT前にプラスミドDNAを線状化することで、リードスルー転写を防ぎ、均一なmRNA転写産物を得ることができます。

• 制限酵素消化：poly(A)テール下流のユニークな制限酵素部位をBspQI、ApaI、NotIなどの酵素で切断します。酵素の選択はプラスミド設計や目的の末端構成に依存します。
• 末端特性：望ましくない転写アーティファクトを防ぐため、3'突出末端を生成する酵素よりも、平滑末端や5'突出末端を生成する酵素が好まれます。
• テンプレート精製：消化後、酵素や小断片はフェノール-クロロホルム抽出とエタノール沈殿、またはシリカスピンカラムなどのカラム精製で除去します。最終テンプレートは高純度、RNaseフリー、未消化プラスミドを含まない状態である必要があります。

In Vitro転写（IVT）

IVTプロセスでは、ファージ由来RNAポリメラーゼを用いて線状DNAテンプレートからin vitroでmRNAを合成します。高収率・高忠実度のmRNA合成は、機能性タンパク質発現から治療用RNA製造まで幅広い用途で重要です。

反応成分

標準的なIVT反応には以下が含まれます。

• RNAポリメラーゼ：T7、SP6、T3 RNAポリメラーゼがテンプレートのプロモーターに応じて使用されます。T7ポリメラーゼは転写効率が高いため最も一般的です。
• ヌクレオシド三リン酸（NTPs）：ATP、GTP、CTP、UTPを等モル濃度（通常4～8mM）で添加し、RNA合成の構成要素とします。
• 反応バッファー：マグネシウムイオン（Mg²⁺）、ジチオスレイトール（DTT、酸化還元バランス維持）、スペルミジン（核酸安定化）などの必須補因子を含みます。
• RNaseインヒビター：RNaseインヒビターを添加し、転写過程で新生RNAの分解を防ぎます。

図2. Saccharomyces cerevisiae RNAP II CTD.（Pal, 2020）

IVT条件の最適化

• NTP濃度：NTP濃度が高すぎると早期終結や切断転写産物が生じ、低すぎると収率が制限されます。バランスの取れた濃度（約4～8mM）が最適です。
• マグネシウムイオン濃度：Mg²⁺はポリメラーゼ活性と忠実性に不可欠です。最適濃度は20～30mMで、テンプレートやスケールに応じて滴定が必要な場合があります。
• インキュベーション条件：標準的なIVT反応は37℃で2～4時間行われます。長時間インキュベーションは収率を高めますが、RNA分解や不純物生成のリスクも高まります。

共転写的修飾

合成mRNAの翻訳性能向上や免疫原性低減のため、転写中に直接いくつかの修飾を導入できます。

5'キャッピング戦略：

• Cap 0（m⁷GpppG）：最も単純な真核生物mRNAキャップ構造。GTPに対してモル過剰で添加し、効果的な取り込みを確保します。
• ARCA（Anti-Reverse Cap Analog）：逆向きキャップの取り込みを防ぎ、正しい5'末端配向を保証してリボソーム認識を高めます。

ヌクレオチド修飾：

• シュードウリジン（Ψ）およびN1-メチルシュードウリジン（m¹Ψ）：これらのアナログは自然免疫認識（例：TLR7/8）を低減し、翻訳効率を高めます。
• 5-メチルシチジン（m⁵C）：ヌクレアーゼ分解に耐性を持たせてmRNA安定性を向上させ、翻訳最適化にも寄与します。
• その他の修飾（例：2-チオウリジン、N6-メチルアデノシン）は、薬理動態改善や炎症シグナル低減を目的とした治療用mRNAエンジニアリングで研究されています。

転写後プロセシング

in vitro転写（IVT）後、得られたRNAは成熟し安定した翻訳能を持つメッセンジャーRNA（mRNA）とするため、一連の転写後修飾および精製工程を経る必要があります。これらのプロセスにより、合成転写産物が構造・機能の両面で天然の真核生物mRNAを模倣し、タンパク質発現やmRNA治療薬など下流用途での有効性が最大化されます。

酵素的キャッピング（共転写的に行わない場合）

共転写的キャッピング戦略やAnti-Reverse Cap Analog（ARCA）の利用が増加していますが、酵素的キャッピングは、キャッピング効率や忠実性の厳密な制御が求められる研究用・治療用mRNA生産において依然として堅牢な選択肢です。

• ワクシニアキャッピング酵素（VCE）：この多機能酵素複合体は、Cap 0（m⁷GpppN）と呼ばれる5'キャップ構造の逐次酵素的付加を触媒します。ここで「m⁷G」は7-メチルグアノシンが5'–5'三リン酸架橋で最初の転写ヌクレオチドに結合していることを示します。VCE活性にはRNAトリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、（グアニン-N7）-メチルトランスフェラーゼ機能が含まれます。キャップは転写産物の安定性、効率的な翻訳開始、エキソヌクレアーゼ分解耐性に重要な役割を果たします。
• 2'-O-メチルトランスフェラーゼ：Cap 0をCap 1（m⁷GpppNm）に変換します。これは最初の転写ヌクレオチドのリボース2'-ヒドロキシル基をメチル化することで実現されます。Cap 1構造は宿主免疫系に「自己」と認識され、Toll様受容体（TLRs）、RIG-I、MDA5による自然免疫応答を大幅に低減します。

酵素的キャッピング法は、未キャップRNAをほぼ定量的に完全なCap 1構造へ変換できるため、ワクチン開発や遺伝子置換療法など高感度用途に特に有用です。

図3. RNA 5'末端キャップ形成に至る逐次酵素活性。（Pal, 2020）

Poly(A)テーリング

プラスミドDNA内にポリアデニル化配列がコードされていない場合、3' poly(A)テールは転写後に酵素的に付加する必要があります。

• Poly(A)ポリメラーゼ（PAP）：RNA転写産物の3'ヒドロキシル末端にアデノシン一リン酸を鋳型非依存的に付加します。この酵素反応は通常、基質としてATPを用い、均一性と適切なテール長を確保するために最適化されたバッファー系で行われます。
• 最適なPoly(A)テール長：経験的研究では、約100～150ヌクレオチドのpoly(A)テールが、転写産物の安定性、翻訳効率、細胞質分解耐性の最良のバランスを提供することが示唆されています。過度な延長は転写産物の折り畳みや翻訳に影響し、短すぎるテールは安定性を損ないます。

ポリアデニル化は、mRNAの半減期および真核細胞でのリボソーム複合体へのリクルートの重要な決定因子です。

DNase処理

IVT反応後に残存するDNAテンプレートは、規制ガイドライン遵守、自然免疫活性化防止、機能アッセイでのバックグラウンド除去のため、厳格に除去する必要があります。

• Turbo DNase（組換えRNaseフリーDNase I）：RNAの完全性を保ったまま、一本鎖・二本鎖DNAを効率的に加水分解します。この処理は通常、IVTおよびポリアデニル化後に行い、加熱失活または精製で酵素を除去します。

DNase処理は治療用途だけでなく、RT-qPCRなどの解析ワークフローでもDNAコンタミが定量を混乱させるため不可欠です。

mRNA精製

精製は治療グレードmRNA生産において最も重要な工程といえます。この段階では、タンパク質、残存DNA、切断転写産物、ヌクレオチド、酵素、エンドトキシンなどの不純物を除去することを目的とします。必要な品質および規制基準を達成するため、さまざまな精製戦略がしばしば組み合わせて用いられます。

沈殿法

沈殿法は、その簡便さ、スケーラビリティ、コスト効率の高さから、広く用いられる一次精製法です。

• 塩化リチウム（LiCl）沈殿：LiClは長鎖RNA種のみを選択的に沈殿させ、タンパク質、短鎖RNA断片、遊離ヌクレオチド、塩類の大部分を上清に残します。標準プロトコルでは4℃でインキュベート後、高速遠心分離を行います。
• エタノール沈殿：通常、塩（例：酢酸ナトリウム）と併用し、希薄溶液からRNAを効率的に回収します。この工程は、酵素処理やクロマトグラフィー精製前のバッファー交換や脱塩にも有用です。

沈殿法は高分解能分離を提供しませんが、多段階精製プロトコルに組み込むことでバルク不純物の低減に役立ちます。

クロマトグラフィー精製

クロマトグラフィーベースの技術は、全長・高純度mRNA転写産物の分離において優れた分解能と特異性を提供します。

• Oligo(dT)アフィニティクロマトグラフィー：poly(A)テールとoligo(dT)結合樹脂（例：セファロースや磁気ビーズ）との親和性を利用します。この方法はpolyadenylated転写産物を選択的に捕捉し、切断RNAや非polyadenylated不純物を除去します。IVT混合物からmRNAを精製するのに特に有効です。
• サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）：分子の水和半径に基づいて分離します。SECは短鎖転写産物、分解RNA、未反応ヌクレオチドを効果的に除去し、全長mRNAの天然構造を保持します。
• イオン交換クロマトグラフィー（IEX）：正味電荷に基づいて核酸を分離します。アニオン交換樹脂（例：DEAEやQ-セファロース）が低塩条件下で一般的に使用されます。塩濃度勾配の微調整により、キャップ有無や全長・切断産物の分離が可能です。

クロマトグラフィー技術は、バッチ間一貫性が求められる臨床グレードmRNA生産で特に有用です。

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）

HPLCはmRNA精製における強力な分析・製造ツールであり、mRNAアイソフォーム、不純物、構造類似種の分離を可能にします。

• 逆相HPLC（RP-HPLC）：RNAとカラムマトリックス間の疎水性相互作用に基づきます。通常C18カラムとイオンペア試薬（例：トリエチルアミン酢酸塩）を用いて分解能を高めます。RP-HPLCは修飾・非修飾mRNA、切断種、残存酵素タンパク質の分離に優れています。
• 疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）：疎水性の違いに基づき、キャップ有無のRNAを識別するのに有用です。HICは品質管理や最終純度向上のための二次精製工程としてよく用いられます。

これらの手法は品質保証（QA）現場で有用であり、mRNA治療薬のGMPパイプラインにも頻繁に組み込まれています。

ろ過ベースの手法

Tangential Flow Filtration（TFF）は、バッファー交換、RNA濃縮、不純物除去においてスケーラブルかつ効率的な手法です。TFFシステムは、分子量カットオフが定義された中空糸またはフラットシート膜を利用し、RNAを保持しつつ小分子や塩類を通過させます。

TFFは上流・下流の両工程で頻繁に使用され、特に大規模mRNA生産に適しています。連続生産戦略にも対応し、高スループット運用に最適です。

図4. 機能性mRNA生産の概要。（Papaioannou et al., 2023）

mRNA生産パイプラインは、DNAテンプレート調製、IVT、キャッピング、精製、厳格な品質管理を含む、綿密に管理されたプロセスです。酵素修飾、クロマトグラフィー精製、分析技術の進歩により、mRNAの収率、安定性、翻訳効率は大きく向上しました。規制枠組みの進化や新技術の登場により、mRNA製造は今後も改善され、より広範な治療応用が可能となるでしょう。

Creative Enzymesでは、プラスミド線状化、in vitro転写、キャッピング、ポリアデニル化など、mRNA生産パイプラインのあらゆる工程に必要な高性能酵素を提供しています。ご質問・お問い合わせはお気軽にどうぞ！