メッセンジャーRNA（mRNA）生産、特にin vitro合成は、現代バイオテクノロジーの基盤であり、ワクチン開発からタンパク質置換療法に至るまでの応用において中心的な役割を果たしています。このプロセスは、mRNAの効率的で高忠実度の合成、成熟、精製を確保する複数の酵素の協調的な働きを含みます。本記事では、in vitro mRNA生産中に使用される重要な酵素の包括的な概要を提供し、ワークフローの各段階におけるそれらの特定の機能と関連性を詳述します。

Creative Enzymesは、プラスミドの線形化からmRNAのキャッピングおよびポリアデニル化に至るまで、このプロセスの各段階に不可欠なmRNA生産用酵素を提供しています。

mRNA生産の概要

mRNAは、DNAにエンコードされた遺伝情報とタンパク質の合成との間の仲介役を果たします。mRNAのin vitro転写（IVT）は、治療開発のための重要なプラットフォームとして浮上しています。機能的で翻訳可能なmRNAの生成には、RNA鎖の合成だけでなく、5'キャッピング、3'ポリアデニル化、厳密な精製などの転写後修飾も必要です。これらのステップは、最終的なmRNA製品の完全性と翻訳効率に寄与する、各々異なるメカニズム的役割を持つ高度に特化した酵素のセットによって媒介されます。

図1. (a) in vitro転写（IVT）mRNAの重要な構造要素の概要。(b) キャップ依存翻訳の開始。キャップ依存翻訳の開始は、真核生物翻訳開始因子4E（eIF4E）が5'キャップに結合することによって始まります。5'キャップに結合したeIF4Eは、さまざまな翻訳開始因子と相互作用し、ポリA結合タンパク質（PABP）も翻訳開始複合体に組み込まれ、mRNAを環状化します。この開始プロセス中に、40sリボソームが開始複合体にリクルートされ、その後翻訳の開始のためにスタートコドンをスキャンします。さらに、40sリボソームは5' UTRに位置するIRESにもリクルートされ、キャップ非依存翻訳を開始します。(Kwon et al., 2018)

in VitroにおけるDNAテンプレートの準備

転写が始まる前に、プロモーター（通常はT7、SP6、またはT3）の制御下にある興味のある遺伝子を含む高品質の線形DNAテンプレートが必要です。この段階で関与する酵素には以下が含まれます：

制限内因子

EcoRI、BamHI、及びBsaIのような制限酵素は、プラスミドDNAを線形化するために一般的に使用されます。線形化は、読み取りを防ぎ、定義されたmRNAの末端を確保するために重要です。

DNAポリメラーゼ

PhusionやQ5のような高忠実度のDNAポリメラーゼは、転写テンプレートを作成または増幅するためにPCR増幅中に使用されます。これらの酵素は、mRNAの機能や安定性を損なう可能性のある変異を減少させるための校正活性を提供します。

in VitroにおけるmRNA生産プロセスの酵素成分

RNAポリメラーゼ：起源と調節

in vitroシステムは、主にバクテリオファージ由来のRNAポリメラーゼ（T7、SP6、またはT3 RNAポリメラーゼ）を利用します。これらの酵素は、単一サブユニットで、プロモーター特異的であり、高度に進行性です。補助タンパク質やクロマチンリモデリングを必要とせず、定義されたバッファー条件下で機能し、適切なファージプロモーターを含むプラスミドまたは線形DNAテンプレートから迅速かつ効率的に転写を行います。

5'キャッピングメカニズム

in vitroキャッピングは、以下のいずれかによって達成できます：

• 転写後的に、ワクチニアウイルスキャッピング酵素と2'-O-メチルトランスフェラーゼを使用します。
• 共転写的に、合成キャップアナログ（Anti-Reverse Cap Analog (ARCA)など）を転写反応に直接組み込むことによって行います。

これらの方法は、自然なキャッピング構造を模倣し、内因性免疫活性を減少させるように設計されていますが、内因性キャッピング複合体の調節コンテキストは欠けています。

3'ポリアデニル化

in vitroでは、ポリアデニル化は以下のいずれかによって達成されます：

• 酵素的に、E. coliまたは酵母のポリ(A)ポリメラーゼを使用し、テンプレートなしで3'末端にアデニン残基を追加します。
• テンプレートコーディング、転写に使用されるDNAテンプレートにポリ(A)テール配列を直接組み込むことによって行います。

酵素的アプローチはテールの長さをより制御できますが、in vivoのようにRNA結合タンパク質や切断部位によって調節されることはありません。

図2. mRNA合成の基本的なワークフロー。mRNAのin vitro合成は、興味のある遺伝子を含むDNAテンプレート（オレンジで示されている）の準備から始まります。これは、線形化されたプラスミドDNA、PCR産物、またはcDNAテンプレートである可能性があります。これらのDNAテンプレートは、RNAポリメラーゼを使用してmRNAのin vitro転写に使用され、その後、5'非翻訳領域でのmRNAキャッピング、3'非翻訳領域でのポリ(A)テールの追加（DNAテンプレートにポリ(A)が含まれている場合はオプション）、および最終的なmRNAの精製が行われます。UTR、非翻訳領域。(Campillo-Davo et al., 2021)

RNA処理酵素と複合体

in vitro mRNA生産は、核RNA処理経路をバイパスします。イントロンは通常、合成mRNA構造から省略され、スプライシングは不要です。RNA編集や核輸出機構は関与しません。代わりに、化学修飾と最適化されたUTR（非翻訳領域）が設計中に組み込まれ、細胞質内での翻訳効率と安定性を向上させます。

ヌクレアーゼと汚染物質管理

in vitro合成中の分解を防ぐために、RNase阻害剤が反応および精製プロセス全体にわたって追加されます。さらに、DNase Iが転写後にDNAテンプレートを分解するために使用され、テンプレートDNA汚染のない純粋なmRNA調製を確保します。

酵素の役割の要約

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