Messenger RNA（mRNA）の生成、特にin vitro合成は、現代バイオテクノロジーの基盤であり、ワクチン開発からタンパク質補充療法に至るまで、さまざまな応用分野で中心的な役割を果たしています。このプロセスには、mRNAの効率的かつ高忠実度な合成、成熟、精製を保証する複数の酵素の協調的な働きが関与しています。本記事では、in vitro mRNA生成において使用される主要な酵素について、その具体的な機能と各ワークフロー段階での重要性を詳しく解説します。

Creative Enzymesは、プラスミドの線状化からmRNAのキャッピングおよびポリアデニル化まで、各段階で不可欠なmRNA生成用酵素を提供しています。

mRNA生成の概要

mRNAは、DNAにコードされた遺伝情報とタンパク質合成の間の仲介役を担っています。mRNAのin vitro転写（IVT）は、治療開発のための重要なプラットフォームとして登場しました。機能的かつ翻訳可能なmRNAを生成するには、RNA鎖の合成だけでなく、5'キャッピング、3'ポリアデニル化、厳格な精製といった転写後修飾も必要です。これらのステップは、高度に専門化された酵素群によって媒介されており、それぞれが最終mRNA製品の完全性と翻訳効率に寄与する独自の機構的役割を担っています。

図1. (a) in vitro転写（IVT）mRNAの必須構造要素の概要。(b) キャップ依存的翻訳開始。キャップ依存的翻訳開始は、真核生物翻訳開始因子4E（eIF4E）が5'キャップに結合することで始まります。5'キャップに結合したeIF4Eは、さまざまな翻訳開始因子と相互作用し、ポリA結合タンパク質（PABP）も翻訳開始複合体に組み込まれ、mRNAを環状化します。この開始過程で、40sリボソームが開始複合体にリクルートされ、翻訳開始のために開始コドンをスキャンします。さらに、40sリボソームは5' UTRに存在するIRESにもリクルートされ、キャップ非依存的翻訳を開始することもできます。（Kwon et al., 2018）

in vitroにおけるDNAテンプレート調製

転写が始まる前に、目的遺伝子がプロモーター（通常はT7、SP6、またはT3）の制御下にある高品質な線状DNAテンプレートが必要です。この段階で関与する酵素には以下が含まれます。

制限エンドヌクレアーゼ

EcoRI、BamHI、BsaIなどの制限酵素は、プラスミドDNAの線状化によく使用されます。線状化は、転写の読み抜けを防ぎ、mRNAの末端を明確にするために重要です。

DNAポリメラーゼ

PhusionやQ5などの高忠実度DNAポリメラーゼは、PCR増幅時に転写テンプレートの作製や増幅に用いられます。これらの酵素は校正活性を持ち、mRNAの機能や安定性を損なう可能性のある変異を減少させます。

in vitroにおけるmRNA生成プロセスの酵素成分

RNAポリメラーゼ：起源と制御

in vitroシステムでは、主にバクテリオファージ由来のRNAポリメラーゼ（T7、SP6、T3 RNAポリメラーゼ）が利用されます。これらの酵素は単一サブユニットで、プロモーター特異的かつ高いプロセシビティを持ちます。補助タンパク質やクロマチンリモデリングを必要とせず、定義されたバッファー条件下で動作し、適切なファージプロモーターを含むプラスミドまたは線状DNAテンプレートから迅速かつ効率的な転写を可能にします。

5'キャッピング機構

in vitroキャッピングは、以下のいずれかの方法で実施できます。

• 転写後、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および2'-O-メチルトランスフェラーゼを使用。
• 転写共役、Anti-Reverse Cap Analog（ARCA）などの合成キャップアナログを転写反応に直接組み込む方法。

これらの方法は、自然なキャッピング構造を模倣し、自然免疫の活性化を低減するよう設計されていますが、内在性キャッピング複合体の制御的文脈は持ちません。

3'ポリアデニル化

in vitroでは、ポリアデニル化は以下のいずれかの方法で行われます。

• 酵素的に、E. coliまたは酵母由来のポリ(A)ポリメラーゼを用いて、鋳型なしで3'末端にアデニン残基を付加。
• テンプレートコード、転写に用いるDNAテンプレートにポリ(A)配列を直接組み込む方法。

酵素的アプローチはテール長の制御がしやすいですが、in vivoのようなRNA結合タンパク質や切断部位による制御は受けません。

図2. mRNA合成の基本的なワークフロー。in vitroでのmRNA合成は、目的遺伝子を含むDNAテンプレート（オレンジで表示）の調製から始まります。これは線状化プラスミドDNA、PCR産物、またはcDNAテンプレートである場合があります。これらのDNAテンプレートは、RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写に使用され、その後5'非翻訳領域でのmRNAキャッピング、3'非翻訳領域でのポリ(A)テール付加（DNAテンプレートにポリ(A)が含まれる場合は省略可能）、最終mRNAの精製が行われます。UTRは非翻訳領域を示します。（Campillo-Davo et al., 2021）

RNAプロセシング酵素および複合体

in vitro mRNA生成では、核内RNAプロセシング経路をバイパスします。イントロンは通常、合成mRNA構築物から省略され、スプライシングは不要です。RNA編集や核外輸送機構も関与しません。その代わり、化学修飾や最適化されたUTR（非翻訳領域）が設計段階で組み込まれ、細胞質内での翻訳効率と安定性が向上します。

ヌクレアーゼおよびコンタミ管理

in vitro合成中の分解を防ぐため、RNaseインヒビターが反応および精製工程全体で添加されます。さらに、DNase Iは転写後にDNAテンプレートを分解し、テンプレートDNAの混入がない純粋なmRNA調製を保証します。

酵素の役割まとめ

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