無機ピロリン酸加水分解酵素

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序論

無機ピロホスファターゼ（PPase）は、核酸およびタンパク質合成などの生合成反応を駆動する無機ピロリン酸（PPi）の細胞内濃度を制御するうえで重要な役割を担う必須酵素である。PPiは生合成反応の副産物として大量に生成され、その濃度はこれら生理反応の細胞内恒常性に影響を及ぼす。PPaseは、対称なピロリン酸（PPi）基質を2分子の無機リン酸（Pi）へ加水分解するという、最も単純なリン酸基転移反応を触媒する。PPaseには4つの異なるクラス（膜内在性M-PPaseおよび可溶性のファミリーI、ファミリーII、ファミリーIII PPase）が存在するが、ファミリーIIIの可溶性PPase（S-PPase）は十分に特性解析されておらず、限られた細菌種にのみ存在する。したがって、残る3つのPPaseファミリーは、主として、あるいは専らピロホスファターゼ触媒に特化した酵素学的ソリューションを提供している。

共通点と相違点

酵素ファミリー、pH、およびPPi濃度に応じて、PPaseによる触媒には3または4個の金属イオンが必要となる場合がある。触媒は脱離基の活性化と有効な求核種の生成に基づき、酵素‐リン酸中間体を介さずに進行する。これは、触媒が無機金属リン酸ケージ内で完結し、タンパク質側鎖は主として補助的役割を担うことを示唆する。ピロリン酸加水分解の観点では、各酵素間の主要な相違は、2つの阻害剤（フッ化物およびジホスホネート、特にアミノメチレンジホスホネート（AMDP））に対する応答の違いと、要求される二価カチオン種の違いである。触媒能については、M-PPaseが最も低速（kcat≈10s^-1）であり、ファミリーI PPaseは約1桁高い（kcat≈200s^-1）。さらにファミリーII酵素はファミリーI酵素の活性より1桁高い（kcat≈2000s^-1）。

可溶性PPase、特にファミリーI酵素は、詳細な構造・機能情報が利用可能であることから、より理解の進んだリン酸基転移酵素の代表例である。ファミリーIおよびファミリーII PPaseの生物学的機能は同一であり、その唯一の目的はピロリン酸の除去である。しかし、配列および構造に相同性はなく、作用機序も異なると考えられる。膜内在性PPase（M-PPase）は可溶性PPaseとは大きく異なる。M-PPaseは、さまざまな低エネルギーストレス条件下における植物および細菌の生存に関与するなど、可溶性PPaseよりも広範な生物学的機能を有する。

表1．PPaseの代表的な速度論的特性ならびにF^-およびAMDPによる阻害

可溶性ピロホスファターゼの構造と機構

ファミリーI PPaseは1952年に初めて結晶化されて以来、広範に研究されており、特にEscherichia coli（EPPase）およびSaccharomyces cerevisiae（YPPase）由来PPaseが詳細に解析されている。ファミリーI PPaseは生物界の全ドメインに存在し、中心に保存された5本鎖のOB-fold βバレルを有するコンパクトな単一ドメイン構造へ折り畳まれ、活性部位はその上部に位置する。真核生物酵素は通常二量体として存在し、細菌酵素は通常六量体である。ファミリーI PPaseにおける配列保存性は活性部位の20残基程度の荷電性・親水性残基を超えてほとんど及ばないものの、保存されたD-(S/G/N)-D-P-ali-D-ali-aliモチーフ（ali＝C/I/L/M/V）により信頼性高く同定できる。ファミリーI PPaseの触媒における顕著な特徴は、基質中の孤立電子対がすべて配位されること、ならびにPPi加水分解が会合機構により進行し、PPiの求電子的リン酸部位が活性化水分子由来の求核種により攻撃されることである。

図1．基質結合コンフォメーションにおけるファミリーI酵母PPase（YPPase、左）（1E6A）、ファミリーII B. subtilis PPase（BsPPase、中央）（2HAW）、およびH⁺ポンプ型ムング豆PPase（VrPPase、右）の全体リボン図の並列比較（Kajander, T.; et al. 2013）

ファミリーII PPaseは細菌および古細菌系統に存在し、特にBacilliおよびClostridiaに多く、複数のヒト病原体も含まれる。ファミリーII PPaseはファミリーI PPaseとは構造的に異なり、これらホモ二量体を形成する2ドメインタンパク質は「DHH」ホスファターゼ・スーパーファミリーに属する。ここでDHHとは、金属イオン結合特異性に重要なN末端ドメインに保存されたAsp-His-Hisモチーフを指す。ファミリーII PPaseの活性部位は、N末端DHHドメインとC末端DHHA2ドメインの間に位置する。前述のとおり、ファミリーII PPaseは金属イオンMn²⁺またはCo²⁺存在下で最も高い触媒活性を示す。遷移金属に対する結合および速度論的選好性は、活性部位のアーキテクチャに基づいて説明できる。

図2．YPPase（左）、BsPPase（中央）、VrPPase（右）の加水分解部位の並列比較。3酵素間における活性部位ジオメトリの詳細な差異を強調（Kajander, T.; et al. 2013）