PRP4キナーゼの発見

25年前、我々を含む複数の研究者は、分裂酵母に見られるイントロンのタイプが、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeに見られるイントロンとは異なるタイプであることを提唱した。この提唱は主として、66 ntのイントロンを含むサルウイルス40（SV40）small T抗原転写産物がSchizosaccharomyces pombeにおいて正確にスプライシングされ、small T抗原タンパク質が合成される一方で、Saccharomyces cerevisiaeでは合成が認められないという観察に基づく。我々は分裂酵母を用い、温度感受性（ts）変異体を作製して、制限温度においてpre-mRNAスプライシング欠損を示す変異体のスクリーニングを行った。これらのスクリーニングのため、ウラシル生合成に関与するカルボキシラーゼをコードする、天然ではイントロンを持たないura4遺伝子を用いて人工レポーター遺伝子を構築した。ura4遺伝子へのイントロン挿入により、Schizosaccharomyces pombeのイントロンはエクソン背景に依存せずに認識され得ることが示され、これが発見につながった。その後、Schizosaccharomyces pombeのイントロンは、現在「イントロン定義（intron definition）」と呼ばれる機構により認識されることが示された。ts変異体に、ura4遺伝子内に108 bpのイントロン配列を含むプラスミドを導入した。次いで、増殖条件（許容温度25℃）および非増殖条件（制限温度36℃）下でのura4-108I転写産物について、mRNAおよびpre-mRNAの存在を比較した。数百のts変異体のうち3株では、許容温度下でura4-108Iレポーター遺伝子のスプライス型（mRNA）および非スプライス型（pre-mRNA）転写産物が認められたが、制限温度へ移行するとmRNAは時間依存的に低下する一方、pre-mRNAは安定に維持された。これは、当該条件下でもura4-108I遺伝子の転写は継続しているが、人工イントロンが除去されないことを示す。さらに、これら変異体ではcdc2転写産物に存在する天然イントロンも制限温度下で除去されなかった。

哺乳類Prp4Kは他の細胞プロセスにも関与する

哺乳類Prp4Kは、多様な細胞内構造体および同定済みタンパク質（例：核内スポット、スプライソーム粒子、クロマチン複合体）と相互作用すること、ならびにキネトコア上のタンパク質と相互作用し、紡錘体組立チェックポイントにおいてタンパク質と共局在することが示されている。

Prp4キナーゼとその基質

2種類のプロテインキナーゼ、すなわち分裂酵母Prp4キナーゼおよびキメラ型マウスPrp4キナーゼ（Schizosaccharomyces pombe由来Prp4のN末端に先行してマウスのキナーゼドメインを有する）は、in vitroにおいてアルギニン／セリン（RS）ドメインのリン酸化活性を示し、哺乳類タンパク質ASF/SF2を基質として濃縮した。ASF/SF2はスプライシング因子のSRスーパーファミリーに属する。SRタンパク質は、1つまたは2つのN末端RNA結合ドメイン（RBD）と、C末端のアルギニン／セリンに富む（RS）ドメインから構成される。哺乳類におけるSRタンパク質スーパーファミリーのメンバーは、構成的スプライシングに関与するとともに、選択的スプライシングの特異的制御因子として機能する。これらは相互作用パートナーに結合し、スプライシングを転写およびRNA輸送と連結する。SRタンパク質の一般的機能は、可逆的リン酸化により制御される。分裂酵母では2種類のSRタンパク質が同定されている。Srp1はN末端にRBDを有し、その後に3つのセリン要素が続く。これらをそれぞれRS1、RS2、RS3と呼び、SRおよびSPジペプチドをさまざまな数で含む。分裂酵母のリン酸化プロテオーム解析により、これら3つのRS要素内の複数のセリンがリン酸化されていることが明らかとなった。Srp2は2つのN末端RBDを有し、C末端にSRおよびSPジペプチドを提示する2つの要素を有する。これらをSR1およびSR2と呼ぶ。同様に、リン酸化タンパク質解析により、これら要素内のリン酸化セリンが検出された。2つの要素（SR1およびSR2）について、セリンを他のアミノ酸に置換し、in vivoで変異の影響を評価する広範な変異解析を実施した。その結果、両要素に存在するセリンをすべて変異させた場合、GFP-Srp2融合タンパク質は核内へ移行できず、細胞内に分布する複数の異なる点状構造として観察された。

参考文献：

1. Luetzelberger M; et al. The Prp4 Kinase: Its Substrates, Function and Regulation in pre-mRNA Splicing. Protein Phosphorylation in Human Health. 2012.