全長cDNAクローンの配列解析により、gekは1613アミノ酸からなる大型タンパク質をコードすることが示された（図1a）。GekのN末端には、Ser/Thrキナーゼの触媒ドメインが予測される（図1b）。これに続いて、ミオシン重鎖と配列相同性を有する大きなコイルドコイルドメイン（図1a）、プロテインキナーゼC（PKC）のホルボールエステル／ジアシルグリセロール結合構造に類似したCysリッチドメイン（図1c）、ならびにプレクストリン相同（PH）ドメイン（図1d）が存在する。PHドメインは、多くのシグナル伝達分子においてタンパク質‐脂質相互作用および細胞表面へのリクルートに関与する。GekのC末端近傍には、Cdc42/Rac interactive binding（CRIB）ドメインに類似した配列が認められる（図1e）。実際、Gekの3残基欠失変異体（GekΔISP）（図1e）はCRIBドメインに保存された3残基に対応し、Dcdc42への結合を阻害する。Gekはヒトのトニックジストロフィー関連プロテインキナーゼ（DMPK）と強い配列類似性を示す。GekとDMPKは、271アミノ酸からなる触媒コア領域内で63%のアミノ酸配列同一性を共有し（図1b）、両タンパク質間の配列類似性は触媒ドメインを超えて両方向に及ぶ（図1a、b）。しかし、DMPKはGekよりもはるかに小さい。興味深いことに、近年同定されたRho結合性キナーゼのクラスは、小型GTPアーゼRhoのエフェクターとして機能し得るとされ、Gekに類似したドメイン構成を有する（図1a）。さらに、Rho結合性キナーゼのキナーゼドメインはDMPKと類似しているが、DMPKはショウジョウバエGekよりも哺乳類Rhoキナーゼにより近い（触媒コアにおける同一性はそれぞれ63%および49%）。同様に、PKCのホルボールエステル結合ドメインは、Rho結合性キナーゼよりもGekのCysリッチドメイン（図1c）により類似している。

図1．Gekの一次構造。（L, Luo; et al. 1997）

Gekはプロテインキナーゼである。

Gekがキナーゼ活性を示すかを検証するため、研究者らは、ユビキタスなアクチンプロモーター制御下でmycエピトープ標識した野生型Gek発現コンストラクトを用い、ショウジョウバエSchneider細胞（S2）にトランスフェクションした。続いて、抗myc抗体を用いてGekタンパク質を免疫沈降した。基質としてヒストンを用いたところ、myc-Gekを導入した細胞の免疫沈降複合体においてキナーゼ活性が検出された一方、モックトランスフェクション細胞からの免疫沈降物では検出されなかった。免疫沈降の過程でGekと近縁の別キナーゼが共沈し、その活性が検出された可能性を排除するため、研究者らはmycタグ付き変異Gekコンストラクト（A105K）をS2細胞にトランスフェクションした。この変異は、キナーゼにおけるリジン残基の置換であり、キナーゼ活性に必須なドメインを障害すると予測される。免疫沈降したmyc-GekA105Kはバックグラウンドを上回るキナーゼ活性を示さなかったが、GekA105Kタンパク質の発現量は野生型Gekと同程度であり、抗myc抗体によるウエスタンブロッティングで確認された。キナーゼドメインの単一アミノ酸置換が、Gekの他の関連タンパク質への結合を破綻させる可能性は低いことから、研究者らはGekタンパク質がキナーゼ活性を有すると結論付けた。

参考文献

1. L, Luo; et al. Genghis Khan (Gek) as a putative effector for Drosophila Cdc42 and regulator of actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1997.