分光光度法アッセイは、古典的な酵素試験法であり、低コストで再現性が高いため、現在でも最も広く使用されているアッセイです。分光光度法アッセイでは、オペレーターは反応溶液によって吸収または散乱される光の強度の変化を測定することで、酵素反応の経過を追跡します。ほとんどの試験では、検出方法としてUV/可視（UV/vis）分光法が使用されており、通常は100～1100 nmの波長範囲に該当します。光が可視領域、すなわち400～700 nm、またはより広く360～900 nmの波長であれば、アッセイの色は肉眼で確認することができます。そのため、この種の試験は比色アッセイとも呼ばれます。

UV/vis分光法を用いて反応速度や触媒効率を測定する場合、反応溶液は基質から生成物への色や明度の変化を示し、その変化はUV/vis分光計で検出できます。その後、この酵素反応の速度定数は、一定期間にわたってUV/vis吸光スペクトルを測定することで定量化できます。多くの場合、最初のステップとして、反応に関与するすべての成分を検出するための最適な波長が決定されます。理想的な波長は、基質と生成物の違いを明確に示し、他の化学物質による干渉が最小限であるべきです。場合によっては、酵素活性を計算するために強いシグナルを得るため、複数の波長を使用する必要があります。例えば、一般的な補酵素であるNADHおよびNADPHは、還元型でUV光を吸収し、酸化型では吸収しないため、酵素活性アッセイで頻繁に使用されます。NADHまたはNADPHを補酵素として使用するオキシドレダクターゼは、酵素反応の進行に伴い補酵素が消費されることを示す340 nmの波長でのUV吸光度の減少を追跡することで特徴付けることができます。

酵素反応を測定する際には、検出器の感度と分光システム全体の安定性が信頼性の高い測定にとって重要です。前者は酵素反応による微細な光強度の変化を検出することを保証し、後者は低い変動とノイズレベルを維持します。この2つの要素が組み合わさることで、装置のシグナル対ノイズ比が制御され、高品質な装置は平均的な装置よりもはるかに多くのケースで酵素活性を測定することができます。

比色アッセイは、酵素活性の検出と測定において同じ原理を使用しますが、UV分光法とは光の波長が異なるだけです。MTTアッセイは比色アッセイの代表的な例です。MTTアッセイは、テトラゾリウム色素を基質として用い、細胞の代謝活性を評価します。一般的に、生存細胞数や細胞の活性レベルは、NAD(P)H依存性細胞オキシドレダクターゼ酵素の活性レベルによって反映されます。生存細胞では、これらの酵素がテトラゾリウム色素MTT［3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド］を還元してフォルマザン体に変換し、紫色を呈するため、酵素活性の定量に容易に利用できます。他にも、XTT、MTS、WSTsなどの色素が同様の目的で使用されることがあり、電子受容体PMS［1-メトキシフェナジンメトサルフェート］と併用されることが多いです。しかし、溶媒、反応条件、細胞活性のメカニズムは、MTTや他のアッセイの結果に大きな影響を与えます。そのため、常にコントロール試験を併用し、結果は別の方法で確認する必要があります。

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