分光光度法アッセイは古典的な酵素テストであり、低コストで堅牢な再現性のため、現在でも最も広く使用されているアッセイです。分光光度法アッセイでは、オペレーターは反応溶液によって吸収または散乱される光の強度の変化を測定することによって酵素反応の進行を追跡します。ほとんどのテストは、検出方法としてUV/可視（UV/vis）分光法を使用し、通常は100-1100 nmの波長範囲に入ります。光が可視領域にある場合、つまり波長が400-700 nm、またはより広く360-900 nmの場合、アッセイの色は肉眼で明確に捉えることができます。したがって、この種のテストは比色アッセイとも呼ばれます。

UV/vis分光法が反応速度や触媒効率を決定するために実施されるとき、反応溶液は反応物から生成物への色や明るさの変化を示し、そのような変化はUV/vis分光計によって検出できます。次に、この酵素反応の速度定数は、一定期間にわたってUV/vis吸収スペクトルを測定することによって定量化できます。最初のステップとして、反応に関与するすべての種を検出するための最適な波長が決定されます。理想的な波長は、反応物と生成物の違いを明確に示すべきであり、他の化学物質からの干渉は最小限に抑えられるべきです。場合によっては、酵素活性を計算するために強い信号を生成するために、複数の波長を使用する必要があります。たとえば、一般的な補因子であるNADHおよびNADPHは、還元型でUV光を吸収し、酸化型では吸収しないため、酵素活性アッセイで頻繁に使用されます。したがって、NADHまたはNADPHを補因子として使用する酸化還元酵素は、340 nmの波長でのUV吸収の減少を追跡することによって特徴付けることができ、これは酵素反応が進行するにつれて補因子が消費される兆候です。

酵素反応を測定する際、検出器の感度と全体の分光システムの安定性は、信頼性のある測定にとって重要です。最初の属性は、酵素反応の光強度の微妙な変化を検出することを保証します。後者は、低い変動とノイズレベルを維持します。これら二つの側面は、信号対雑音比を制御し、高品質の機器は平均的な機器よりもはるかに多くのケースで酵素活性をテストできます。

比色アッセイは、酵素活性を検出し測定する際に同じ原則を使用しますが、UV分光法とは光の波長が異なります。MTTアッセイは比色アッセイの典型的な例です。MTTアッセイは、細胞の代謝活性を評価するために基質としてテトラゾリウム染料を使用します。一般的に、生存可能な細胞の数または細胞の活力レベルは、NAD(P)H依存性細胞酸化還元酵素の活性レベルによって反映されます。生存している細胞では、酵素がテトラゾリウム染料MTT [3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド] をフォルマザン型に還元し、紫色を呈し、酵素活性を定量化するのに容易に使用できます。他の染料も同様の目的で使用でき、XTT、MTS、WSTなどが含まれ、しばしば電子受容体PMS [1-メトキシフェナジンメトスルフェート] と組み合わせて使用されます。しかし、溶媒、反応条件、および細胞活性メカニズムは、MTTや他のアッセイの結果に大きな影響を与えます。したがって、常にコントロールテストを実施し、結果は別の方法で確認する必要があります。

関連サービス

酵素学アッセイ
酵素活性測定
酵素触媒メカニズム