分光光度法アッセイは古典的な酵素試験であり、低コストで堅牢な再現性を有することから、現在でも最も広く使用されているアッセイの一つである。分光光度法アッセイでは、反応溶液が吸収または散乱する光の強度変化を測定することにより、オペレーターが酵素反応の進行を追跡する。多くの試験では検出法として紫外・可視（UV/Vis）分光法が用いられ、通常、波長範囲は100～1100 nmに及ぶ。光が可視域、すなわち波長400～700 nm（より広義には360～900 nm）にある場合、アッセイの色調は肉眼でも視認可能である。このため、この種の試験は比色アッセイ（colorimetric assay）とも呼ばれる。

UV/Vis分光法を用いて反応速度または触媒効率を評価する場合、反応溶液は反応物から生成物への移行に伴い色調または明度の変化（ドリフト）を示し、これらの変化はUV/Vis分光光度計により検出される。続いて、一定時間にわたりUV/Vis吸収スペクトルを測定することで、この酵素反応の速度定数を定量化できる。多くの場合、最初のステップとして、反応に関与する全ての化学種を検出するための最適波長を決定する。理想的な波長は、反応物と生成物の差異を明確に示しつつ、他の化学物質による干渉が最小限に抑えられるものである。酵素活性の算出に十分な強度のシグナルを得るため、複数波長を用いる必要がある場合もある。例えば、一般的な補酵素であるNADHおよびNADPHは、還元型ではUV光を吸収する一方、酸化型では吸収しないため、酵素活性アッセイで頻用される。したがって、NADHまたはNADPHを補酵素として用いる酸化還元酵素は、反応進行に伴う補酵素消費の指標として、波長340 nmにおけるUV吸光度の低下を追跡することで特性評価できる。

酵素反応を測定する際には、検出器の感度および分光システム全体の安定性が、信頼性の高い測定にとって極めて重要である。前者は酵素反応に伴う光強度の微小な変化を検出することを保証し、後者は変動およびノイズレベルを低く維持する。これら2つの要素は共同して装置のS/N比（信号対雑音比）を規定し、高品質な装置は平均的な装置よりもはるかに多様な条件下で酵素活性を測定できる。

比色アッセイは、酵素活性の検出および測定において同一の原理を用いるが、UV分光法と異なるのは使用する光の波長である。MTTアッセイは比色アッセイの代表例である。MTTアッセイでは、細胞代謝活性を評価するためにテトラゾリウム色素を基質として用いる。一般に、生存細胞数または細胞の活性レベルは、NAD(P)H依存性の細胞内酸化還元酵素の活性レベルによって反映される。生存細胞では、これらの酵素がテトラゾリウム色素MTT［3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド］を還元してホルマザン体へ変換し、ホルマザンは紫色を呈するため、酵素活性の定量に容易に利用できる。同様の目的で、XTT、MTS、WST類などの他の色素も使用可能であり、しばしば電子受容体であるPMS［1-メトキシフェナジンメトサルフェート］と併用される。しかし、溶媒、反応条件、および細胞活性の機序は、MTTまたは他のアッセイ結果に重大な影響を及ぼす。したがって、必ず並行して対照試験を実施し、結果は別法により確認することが望ましい。 

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