mRNAベースのワクチンと治療法の登場は、COVID-19ワクチンの迅速な開発に見られるように、現代医学に革命をもたらしました。従来の生物製剤とは異なり、mRNAはほぼ任意の興味のあるタンパク質をコードすることができる柔軟で迅速な生産プラットフォームを提供します。しかし、高品質のmRNAを製造するには、効果、安定性、安全性を確保するために、生産パイプラインの各ステップを厳密に管理する必要があります。

Creative Enzymesでは、T7 RNAポリメラーゼ、RNase阻害剤、DNase I、ワクシニアキャッピング酵素など、mRNA生産のためのさまざまな酵素を提供しています。ここでは、mRNA生産プロセスを体系的に紹介し、収量、純度、機能性に影響を与える重要なパラメータを強調します。

図1. リニア化されたDNAプラスミドテンプレートから作成されたmRNAのin vitro転写プロセス。(Knezevic et al., 2021)

DNAテンプレートの準備

合成mRNA生産のための効率的なin vitro転写（IVT）は、最も一般的にはエンジニアリングされたプラスミドの形でDNAテンプレートを慎重に準備することから始まります。このテンプレートは転写の設計図として機能し、得られるmRNA製品の忠実度、安定性、翻訳効率に直接影響を与えます。

プラスミド設計とエンジニアリング

DNAテンプレートとして使用されるプラスミドは、最適な転写とその後の翻訳活性を確保するために設計された合成構造です。典型的なmRNAコーディングプラスミドは、以下のコア要素で構成されています：

• プロモーター配列: これは、通常T7、SP6、またはT3などのバクテリオファージ由来のDNA依存性RNAポリメラーゼの結合部位です。プロモーターは高収量のin vitro転写を促進し、通常は5'非翻訳領域（UTR）のすぐ上流に配置されます。
• 5'非翻訳領域（5' UTR）: 最適なリボソームのリクルートメントのために設計されており、5' UTRは翻訳効率を向上させます。重要な特徴には、Kozakコンセンサス配列とリボソームスキャンを促進するための最小限の二次構造が含まれます。
• オープンリーディングフレーム（ORF）: これは、興味のあるタンパク質のコーディング配列です。ターゲットホストの翻訳機構に合わせたコドン最適化が行われ、翻訳効率を向上させ、潜在的な免疫原性を低下させます。
• 3'非翻訳領域（3' UTR）: 3' UTRには、mRNAの安定性と翻訳制御を調節する配列要素が含まれています。一般的な安定性モチーフには、ヒトβ-グロビンまたはα-グロビン遺伝子由来のものが含まれます。
• ポリアデニル化信号とポリ(A)テール: プラスミド内でコーディングされているか、転写後に追加されるもので、3'末端に70〜120のアデノシン残基のストレッチがあり、自然な真核生物の転写物を模倣することでmRNAの安定性と翻訳効率を向上させます。

設計上の重要な考慮事項：

• コドン最適化: 希少コドンをターゲット発現系で好まれる同義コドンに置き換えることで、アミノ酸配列を変更することなく翻訳を向上させます。
• 免疫原性モチーフの回避: メチル化されていないCpGアイランド、ポリ(U)配列、または他の病原体関連分子パターン（PAMP）の存在は、自然免疫応答を刺激する可能性があります。これらの配列は、配列エンジニアリング中に最小限に抑えられるか排除されます。

プラスミドの増殖と精製

設計の後、エンジニアリングされたプラスミドは、転写反応に使用するためにスケールで増殖および精製されなければなりません。

• 細菌増幅: プラスミドは、高コピー株のEscherichia coli（例：DH5α）に導入され、形質転換を通じて行われます。培養は、プラスミドの保持を確保するために選択的抗生物質（アンピシリン、カナマイシンなど）の存在下で行われます。
• プラスミド精製: 細菌培養物を収穫し、アルカリライシス法を使用してプラスミドを抽出し、その後精製ステップを行います。商業的なシリカカラムベースのキットが広く使用されています。超純度のDNAが必要な研究（例：治療グレードのmRNA）には、塩化セシウム（CsCl）勾配超遠心分離が使用されることがあります。

品質管理措置：

• アガロースゲル電気泳動: プラスミドの完全性と、最も転写に適した超螺旋型の優位性を確認します。
• 分光光度計（A260/A280およびA260/A230比）: DNAの濃度と純度を評価します。許容される純度比は、一般的にA260/A280で約1.8、A260/A230で2.0を超えます。

プラスミドDNAのリニア化

プラスミドDNAは、読み取りの転写を防ぎ、均一なmRNA転写物を得るためにIVTの前にリニア化されなければなりません。

• 制限酵素消化: ポリ(A)テールの下流にあるユニークな制限部位を、BspQI、ApaI、またはNotIなどの酵素を使用してターゲットにします。酵素の選択は、プラスミドの設計と望ましい最終構成に依存します。
• エンド特性: 不要な転写アーティファクトを防ぐために、ブランクエンドまたは5'オーバーハングを生成する酵素が、3'オーバーハングを生成する酵素よりも好まれます。
• テンプレート精製: 消化後、酵素と小さな断片は、フェノール-クロロホルム抽出を使用して除去され、その後エタノール沈殿またはカラムベースの精製（例：シリカスピンカラム）を行います。最終的なテンプレートは、高純度でRNaseフリー、未消化のプラスミドが含まれていない必要があります。

in Vitro転写（IVT）

IVTプロセスは、ファージ由来のRNAポリメラーゼを使用してリニアDNAテンプレートをコピーすることにより、in vitroでmRNAを合成します。高収量、高忠実度のmRNA合成は、機能的なタンパク質発現から治療用RNA製造までのアプリケーションにとって重要です。

反応成分

標準的なIVT反応には以下が含まれます：

• RNAポリメラーゼ: T7、SP6、またはT3 RNAポリメラーゼが、テンプレート内の対応するプロモーターに基づいて使用されます。T7ポリメラーゼは、その高い転写効率のために最も一般的です。
• ヌクレオチド三リン酸（NTPs）: ATP、GTP、CTP、およびUTPの等モル濃度、通常は4〜8 mMの範囲で、RNA合成のためのビルディングブロックを提供します。
• 反応バッファー: マグネシウムイオン（Mg²⁺）、酸化還元バランスを維持するためのジチオスレイトール（DTT）、および核酸を安定化させるためのスペルミジンなどの必須補因子を含みます。
• RNase阻害剤: RNase阻害剤が追加され、転写プロセス中に新生RNAが分解されるのを防ぎます。

図2. Saccharomyces cerevisiae RNAP II CTD。(Pal, 2020)

IVT条件の最適化

• NTP濃度: 過度に高いNTP濃度は早期終結や切断された転写物を引き起こす可能性があり、不十分なレベルは収量を制限する可能性があります。バランスの取れた濃度（約4〜8 mM）が最適です。
• マグネシウムイオン濃度: Mg²⁺はポリメラーゼの活性と忠実度に重要です。最適な濃度は20〜30 mMの範囲で、テンプレートとスケールに基づいて滴定が必要な場合があります。
• インキュベーションパラメータ: 標準的なIVT反応は37°Cで2〜4時間行われます。長時間のインキュベーションは収量を増加させる可能性がありますが、RNAの分解や不純物の形成のリスクも高まります。

共転写修飾

合成mRNAの翻訳性能を向上させ、免疫原性を低下させるために、転写中にいくつかの修飾を直接組み込むことができます。

5'キャッピング戦略：

• キャップ0 (m⁷GpppG): 真核生物mRNAキャップの最も単純な形。効果的な取り込みを確保するために、GTPに対してモル過剰で追加されることが多いです。
• ARCA（逆キャップアナログ防止剤）: 逆キャップの取り込みを防ぎ、正しい5'末端の向きを確保し、リボソームの認識を向上させます。

ヌクレオチド修飾：

• 擬似ウリジン（Ψ）およびN1-メチル擬似ウリジン（m¹Ψ）: これらのアナログは自然免疫の認識を減少させ（例：TLR7/8による）、翻訳効率を向上させます。
• 5-メチルシチジン（m⁵C）: 核酸分解酵素による分解に抵抗し、mRNAの安定性を向上させ、翻訳の最適化に寄与します。
• その他の修飾（例：2-チオウリジン、N6-メチルアデノシン）は、薬物動態を改善し、炎症シグナルを減少させるために治療用mRNAエンジニアリングにおいて探求されています。

転写後処理

in vitro転写（IVT）の後、得られたRNAは成熟した、安定した、翻訳可能なメッセンジャーRNA（mRNA）を得るために、一連の転写後修飾と精製ステップを経なければなりません。これらのプロセスは、合成転写物が構造と機能の両方で自然な真核生物mRNAを模倣することを保証し、タンパク質発現やmRNAベースの治療法などの下流アプリケーションにおけるその効果を最大化します。

酵素的キャッピング（共転写的に行われない場合）

共転写的キャッピング戦略や逆キャップアナログ（ARCA）の使用がますます好まれる一方で、酵素的キャッピングは、キャッピング効率と忠実度を正確に制御する必要がある研究グレードおよび治療グレードのmRNA生産において、依然として堅牢な代替手段です。

• ワクシニアキャッピング酵素（VCE）: この多機能酵素複合体は、キャップ0（m⁷GpppN）として知られる5'キャップ構造の逐次酵素的追加を触媒します。「m⁷G」は、最初に転写されたヌクレオチドに5'–5'三リン酸ブリッジで結合した7-メチルグアノシンを示します。VCEの活性には、RNA三リン酸加水分解酵素、グアニル基転移酵素、および（グアニン-N7）-メチルトランスフェラーゼの機能が含まれます。キャップは、転写物の安定性、効率的な翻訳開始、および外因性分解に対する抵抗に重要な役割を果たします。
• 2'-O-メチルトランスフェラーゼ: キャップ0をキャップ1（m⁷GpppNm）に変換し、最初に転写されたヌクレオチドのリボース2'-ヒドロキシル基をメチル化します。キャップ1構造は、宿主免疫系によって「自己」として認識され、Toll様受容体（TLR）、RIG-I、およびMDA5によって媒介される自然免疫応答を大幅に減少させます。

酵素的キャッピング法は、未キャップRNAを完全にキャップされたキャップ1構造にほぼ定量的に変換することを可能にし、特にワクチン開発や遺伝子置換療法などの敏感なアプリケーションに役立ちます。

図3. RNA 5'末端キャップに至る逐次酵素活性。(Pal, 2020)

ポリ(A)テーリング

プラスミドDNA内にエンコードされたポリアデニル化トラクトがない場合、3'ポリ(A)テールは転写後に酵素的に追加されなければなりません。

• ポリ(A)ポリメラーゼ（PAP）: RNA転写物の3'ヒドロキシル末端にアデノシン一リン酸をテンプレート非依存的に追加する反応を触媒します。この酵素反応は通常、ATPを基質として利用し、均一性と適切なテール長を確保するために最適化されたバッファーシステムで行われます。
• 最適なポリ(A)テール長: 経験的研究によると、約100〜150ヌクレオチドのポリ(A)テールが、転写物の安定性、翻訳効率、細胞質内分解に対する抵抗の最良の妥協を提供します。過度の延長は転写物の折りたたみや翻訳に影響を与え、短いテールは安定性を損なう可能性があります。

ポリアデニル化は、真核細胞におけるmRNAの半減期とリボソーム複合体へのリクルートメントの重要な決定因子です。

DNase処理

IVT反応からの残留DNAテンプレートは、規制ガイドラインに準拠し、自然免疫の活性化を防ぎ、機能アッセイにおけるバックグラウンドを排除するために厳密に除去されなければなりません。

• ターボDNase（再組換えRNaseフリーDNase I）: RNAの完全性を保持する条件下で、一本鎖および二本鎖DNAを効率的に加水分解します。この処理は通常、IVTおよびポリアデニル化後に行われ、酵素を除去するために熱不活化または精製が行われます。

DNase処理は、治療用アプリケーションだけでなく、DNA汚染が定量化を混乱させる可能性のあるRT-qPCRなどの分析ワークフローにも不可欠です。

mRNA精製

精製は、治療グレードのmRNAの生産において最も重要なステップであると言えます。この段階では、タンパク質、残留DNA、切断された転写物、ヌクレオチド、酵素、エンドトキシンなどの不純物を除去することを目的としています。必要な品質と規制基準を達成するために、さまざまな精製戦略が採用され、しばしば組み合わせて使用されます。

沈殿法

沈殿は、その単純さ、スケーラビリティ、コスト効率のために、広く使用される主要な精製方法のままです。

• 塩化リチウム（LiCl）沈殿: LiClは、長いRNA種を選択的に沈殿させ、ほとんどのタンパク質、短いRNA断片、遊離ヌクレオチド、塩を上清に残します。標準的なプロトコルは、4°Cでのインキュベーションとその後の高速遠心分離を含みます。
• エタノール沈殿: 通常、塩（例：酢酸ナトリウム）と組み合わせて使用され、エタノール沈殿は希薄溶液からRNAを効率的に回収します。このステップは、酵素処理やクロマトグラフィー精製の前にバッファー交換や脱塩に特に役立ちます。

沈殿は高解像度の分離を提供しませんが、バルク不純物を減少させるために多段階精製プロトコルに統合されることがよくあります。

クロマトグラフィー精製

クロマトグラフィーに基づく技術は、フルレングスで高純度のmRNA転写物の分離に優れた解像度と特異性を提供します。

• オリゴ(dT)親和性クロマトグラフィー: ポリ(A)テールとオリゴ(dT)結合樹脂（例：セファロースまたは磁気ビーズ）との親和性を利用します。このアプローチは、ポリアデニル化された転写物を選択的に捕捉し、切断されたRNAや非ポリアデニル化の汚染物を除去します。これは、IVT混合物からmRNAを精製するのに特に効果的です。
• サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）: 分子を水力半径に基づいて分離します。SECは、短い転写物、分解されたRNA、および未取り込まれたヌクレオチドを効果的に除去しながら、フルレングスmRNAの天然の構造を保持します。
• イオン交換クロマトグラフィー（IEX）: 核酸をネット電荷に基づいて分離します。陰イオン交換樹脂（例：DEAEまたはQ-セファロース）は、低塩条件下で一般的に使用されます。塩勾配の微調整により、キャップ付きと未キャップのmRNA、フルレングスと切断された製品の分離が可能になります。

クロマトグラフィー技術は、臨床グレードのmRNAを生産する際に特に有用であり、高いバッチ間の一貫性が求められます。

高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）

HPLCは、mRNA精製における強力な分析および調製ツールであり、mRNAアイソフォーム、不純物、構造的に類似した種の分離を可能にします。

• 逆相HPLC（RP-HPLC）: RNAとカラムマトリックス間の疎水性相互作用に基づいています。通常、C18カラムとイオン対試薬（例：トリエチルアンモニウムアセテート）を使用して解像度を向上させます。RP-HPLCは、修飾されたmRNAと未修飾のmRNA、切断された種、および残留酵素タンパク質を解決するのに優れています。
• 疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）: 疎水性の違いに基づいてキャップ付きと未キャップのRNAを区別するのに役立ちます。HICは、品質管理ツールとして、または最終的な純度を向上させるための二次精製ステップとしてよく使用されます。

これらの方法は、品質保証（QA）設定で価値があり、mRNAベースの治療法のための良好な製造慣行（GMP）パイプラインに頻繁に統合されます。

フィルトレーションベースの方法

タンジェンシャルフローフィルトレーション（TFF）は、バッファー交換、RNA濃縮、および不純物除去のためのスケーラブルで効率的な方法です。TFFシステムは、RNAを保持しながら小分子や塩の通過を許可する定義された分子量カットオフを持つ中空繊維またはフラットシート膜を利用します。

TFFは、特に大規模なmRNA生産において、上流および下流の処理段階の両方で頻繁に使用されます。連続製造戦略と互換性があり、高スループット操作に適しています。

図4. 機能的mRNAの生産の概要。(Papaioannou et al., 2023)

mRNA生産パイプラインは、DNAテンプレートの準備、IVT、キャッピング、精製、および厳格な品質管理を含む、厳密に制御されたプロセスです。酵素的修飾、クロマトグラフィー精製、および分析技術の進歩により、mRNAの収量、安定性、および翻訳効率が大幅に向上しました。規制の枠組みが進化し、新しい技術が登場するにつれて、mRNA製造は改善され続け、より広範な治療アプリケーションを可能にします。

Creative Enzymesでは、プラスミドのリニア化、in vitro転写、キャッピング、ポリアデニル化を含むmRNA生産パイプラインの各ステップで必要な高性能酵素を提供しています。お問い合わせをお待ちしております！