メッセンジャーRNA（mRNA）は、一時的で情報豊富なバイオ分子であり、遺伝子発現において重要な役割を果たします。その酵素的分解に対する脆弱性は、特に治療および合成生物学の応用において、in vivoおよびin vitroの両方で重大な課題をもたらします。Creative Enzymesと共に、mRNAを酵素的分解から保護するために使用される複雑な細胞戦略と工学的介入を探求し、ヌクレアーゼ、転写後修飾、細胞内局在、RNA結合タンパク質、外因性保護技術に焦点を当てます。

はじめに

mRNAは、DNAとタンパク質合成の間の重要な仲介者として機能し、核からリボソームへ遺伝情報を運びます。その中心的な役割にもかかわらず、mRNAはその一本鎖構造とリボヌクレアーゼ（RNase）への感受性のために本質的に不安定です。真核細胞において、mRNAの半減期は厳密に調節されており、遺伝子発現を微調整することが可能です。しかし、治療的文脈では、mRNAは分解される前に機能的なタンパク質に翻訳されることを確実にするために安定化される必要があります。

細胞がどのように自然にmRNAを保護し、これらのメカニズムが合成システムでどのように利用または模倣されるかを理解することは、mRNAベースの技術を進展させるために重要です。この記事では、mRNAを酵素的攻撃から守るために採用される自然および工学的戦略の包括的な概要を提供します。

mRNAを分解する細胞酵素

mRNAの分解は、転写物の安定性と寿命を決定することによって遺伝子発現を制御する重要な調節プロセスです。このプロセスは、発生の合図、ストレス、環境信号に応じてRNAの安定性を調整するさまざまなリボヌクレアーゼと細胞メカニズムによって厳密に調整されています。

エンドヌクレアーゼ

エンドヌクレアーゼは、RNA分子の内部切断を触媒し、しばしば迅速な転写物の不安定化を引き起こします。真核細胞において、RNase AやRNase Lなどの主要なエンドヌクレアーゼは、RNAのターンオーバーと免疫防御において重要な役割を果たします。RNase Aは、ピリミジン残基で一本鎖RNAを切断し、RNA除去のために分子生物学で広く利用されているよく特徴づけられた酵素です。RNase Lは、インターフェロン調節型2'-5'オリゴアデニル酸合成酵素（OAS）経路の一部であり、ウイルス感染中に活性化され、ウイルスRNAと宿主RNAの両方を分解し、抗ウイルス応答とアポトーシスシグナルに寄与します。

エクソヌクレアーゼ

エクソヌクレアーゼは、分子の5'または3'末端から順次ヌクレオチドを除去することによってRNAを分解します。5'-to-3'エクソヌクレアーゼXrn1は、細胞質mRNAの崩壊の重要な要素であり、特に5'キャップ構造の除去後に活発です。対照的に、エクソソーム複合体は、複数のタンパク質からなる3'-to-5'エクソヌクレアーゼであり、デアデニル化後に転写物を分解し、核および細胞質のRNA監視とターンオーバーに関与しています。これらのエクソヌクレアーゼは、欠陥のある、異常な、または古くなったmRNAの除去に不可欠です。

特化したリボヌクレアーゼ

一般的なヌクレアーゼに加えて、特定のリボヌクレアーゼは、特定のシグナル伝達経路に応じて活性化されます。顕著な例は、内因性ストレス条件下で活性化されるエンドリボヌクレアーゼであるイノシトール要求酵素1（IRE1）です。IRE1は、特定のmRNAを切断し、タンパク質の折りたたみ負荷を軽減し、恒常性を回復します。このような特化したリボヌクレアーゼは、遺伝子発現を微調整し、ストレス下で細胞の完全性を維持するために不可欠です。

mRNA保護のための自然な細胞メカニズム

転写物の完全性を保ち、遺伝子発現を調節するために、真核細胞はmRNA分子を早期分解から保護する複数の保護メカニズムを採用しています。これには、5'末端のキャッピング、3'末端のポリアデニル化、RNA結合タンパク質との結合、細胞内の区画化、構造的なコンフォメーションが含まれます。

5'キャッピング

真核mRNAの5'末端は、7-メチルグアノシン（m⁷G）キャップの追加によって転写共に修飾されます。このキャップ構造は、5'-to-3'エクソヌクレアーゼによる分解を防ぐことによって転写物の安定性を高め、核輸出、スプライシング、および翻訳開始を促進します。核内のキャップ結合複合体（CBC）と細胞質の真核開始因子4E（eIF4E）は、キャップ構造を認識して結合し、mRNA代謝と翻訳調節において中心的な役割を果たします。

図1. 5'キャップ構造（キャップ-2）。

ポリアデニル化

前駆体mRNAのポリアデニル化によって生成される3'ポリ（A）テールは、転写物の安定性と翻訳効率において重要な要素です。ポリ（A）結合タンパク質（PABP）はポリ（A）テールに結合し、eIF4Gなどの翻訳開始因子と相互作用してリボソームのリクルートを強化します。ポリ（A）テールは、3'-to-5'エクソヌクレアーゼによるアクセスを防ぎます。テールはデアデニル化酵素によって徐々に短くなるにつれて、mRNAは分解に対して感受性を持ち、転写物のターンオーバーの始まりを示します。

図2. 最小ポリ（A）サイトは、ポリアデニル化シグナルと下流要素の2つのRNAモチーフで構成されています。ポリ（A）シグナルは、前駆体RNAが切断されポリアデニル化されるポリ（A）切断部位の20〜30ヌクレオチド上流に通常位置しています。ポリ（A）シグナルはCPSFによって認識され、CPSFはDSEに結合したCFII_mおよびPAPと相互作用します。（Schrom et al., 2013）

RNA結合タンパク質

多数のRNA結合タンパク質（RBP）がmRNA分子と相互作用し、その安定性、局在、および翻訳運命を調節します。たとえば、HuR（ELAVL1）は、特にストレスや増殖刺激の下で、3'非翻訳領域（UTR）にAUリッチ要素（ARE）を含むmRNAを安定化します。対照的に、トリステトラプロリン（TTP）などのタンパク質は、AREを含む転写物に分解機構をリクルートすることによってmRNAの崩壊を促進します。安定化RBPと不安定化RBPの間の動的な相互作用は、多様な転写後調節メカニズムを提供します。

図3. タンパク質とRNAの間の機能的相互作用。a | RNA結合タンパク質（RBP）は、RNA代謝と機能を調節するために定義されたRNA結合ドメインを介してRNAと相互作用できます。b | 逆に、RNAはRBPに結合してその運命と機能に影響を与えることができます。（Hentze et al., 2018）

細胞内局在

細胞内のmRNAの空間分布もその安定性に寄与します。転写物は、ストレス顆粒や処理体（P体）などの特定の細胞質焦点に局在することがあります。ストレス顆粒は、細胞ストレス中に非翻訳mRNAの一時的な貯蔵場所であり、転写物を分解から保護する役割を果たします。P体はmRNA崩壊機構の成分を含み、貯蔵および分解機能の両方に関与しています。この区画化により、細胞は生理的条件に応じて翻訳と分解を動的に調節できます。

図4. ストレスに応じたmRNAのストレス顆粒と処理体への隔離。ストレスによって引き起こされる翻訳の停止は、影響を受けたmRNA転写物をP体やストレス顆粒に隔離することにつながる可能性があります。これらの顆粒には、サイレントmRNA、RNA結合タンパク質、および翻訳開始因子が含まれており、ドッキング時に交換されることがあります。P体に含まれるmRNAは、長期貯蔵に加えて分解を受ける可能性があります。ストレスが解消されると、これらの顆粒に貯蔵されたmRNAは翻訳を再開するために放出されます。（Breedon and Storey, 2022）

環状化と閉ループ形成

効率的な翻訳と分解からの保護は、mRNAの閉ループ構造の形成によってさらに強化されます。この構造は、5'キャップ結合タンパク質（eIF4E）と3'ポリ（A）結合タンパク質（PABP）との相互作用によって生じ、足場タンパク質eIF4Gによって媒介されます。閉ループ構造は、リボソームのリサイクルと翻訳開始を促進し、同時にmRNAの末端へのエクソヌクレアーゼのアクセスを妨げ、転写物の寿命を促進します。

図5. ポリ（A）結合タンパク質（PABP）が3'-ポリ（A）テールに結合し、キャップ結合開始因子であるeIF4Eと関連する足場開始因子eIF4Gとの相互作用によって形成される「閉ループ」mRNA構成の概略図。(A) (B) miRNAが3'-UTRターゲット部位に結合することがこのような閉ループに干渉する可能性のある方法。（Standart and Jackson, 2007）

免疫監視とmRNAの完全性

メッセンジャーRNA（mRNA）の完全性は、正確な遺伝子発現とタンパク質合成に不可欠です。細胞は、異常なmRNAを検出して排除するための複雑な品質管理システムと免疫監視メカニズムを進化させており、正しく処理され機能する転写物のみが翻訳されることを保証します。さらに、mRNA工学と合成生物学の進展により、転写物の安定性を高め、免疫認識を軽減するための高度な戦略が導入されています。

RNA品質管理経路

真核細胞は、mRNAの完全性を監視し、切断されたり有害なタンパク質を生成する可能性のある欠陥のある転写物の蓄積を防ぐために、高度に保存されたRNA監視経路の一連を利用しています。これらの中で、ナンセンス媒介崩壊（NMD）、ノンストップ崩壊（NSD）、およびノーゴ崩壊（NGD）は、重要な転写後の品質管理メカニズムとして機能します：

• NMDは、スプライシングエラーや変異によってしばしば生じる早期終止コドン（PTC）を含むmRNAを迅速に分解することを目的としています。
• NSDは、フレーム内のストップコドンを欠く転写物を排除し、リボソームの停止と異常ペプチドの生成を防ぎます。
• NGDは、リボソームが強い二次構造、希少コドン、または伸長を妨げる損傷した領域に遭遇したときに活性化され、エンドヌクレアーゼをリクルートして切断と崩壊を開始します。

これらのメカニズムは、翻訳される前に機能不全の転写物を排除することによって、遺伝子発現の忠実性を確保します。

図6. mRNA品質管理システムにおける終止因子の新機能化。S. cerevisiaeに対して説明された3つのシステムが示されています。NSD（ノンストップ崩壊）は、ストップコドンを欠く転写物の分解を担当します。NGD（ノーゴ崩壊）は、翻訳を妨げるmRNAの二次構造を除去します。NMD（ナンセンス媒介崩壊）は、ナンセンス変異を含む転写物を破壊します。（Zhouravleva and Bondarev, 2011）

自然免疫センサー

品質管理に加えて、細胞は自己と非自己RNAを区別するために自然免疫受容体を利用します。細胞質パターン認識受容体（PRR）、例えばレチノイン酸誘導遺伝子I（RIG-I）やメラノーマ分化関連タンパク質5（MDA5）は、外国または不適切に修飾されたRNAを検出する上で重要です：

• RIG-Iは主に短い二本鎖RNAと5'-トリフォスフェートRNAを認識します—これはウイルス転写物に共通する特徴です。
• MDA5は、ウイルス複製中に生成されることが多い長い二本鎖RNA構造を感知します。

これらのセンサーの活性化は、タイプIインターフェロン応答の誘導と、検出されたRNA種のその後の分解につながります。この免疫監視を回避するために、真核mRNAおよび合成mRNA構造は、免疫原性を低下させ、PRRの活性化を減少させるために、擬似ウリジン（Ψ）や2'-O-メチル化などの転写後修飾を一般的に取り入れています。

mRNAを保護するための工学的戦略

合成生物学の最近の進展により、安定性、翻訳効率が向上し、免疫クリアランスに対する感受性が低下した工学的mRNA構造の開発が可能になりました。これらの戦略は、ヌクレオチドレベルの修飾からデリバリーシステムの強化にまで及びます。

化学修飾

ヌクレオチド塩基への化学的変更は、mRNAの安定性を高め、RNaseや免疫受容体による認識を減少させるために使用されます。一般的に使用される修飾には以下が含まれます：

• 擬似ウリジン（Ψ）：塩基対形成能力を高め、免疫刺激効果を減少させます。
• N1-メチル擬似ウリジン（m¹Ψ）：翻訳をさらに強化し、自然免疫応答を抑制します。
• 5-メチルシチジン（m⁵C）：転写物の安定性に寄与し、TLR媒介の検出から逃れるのに役立ちます。

これらの修飾は、免疫耐性とタンパク質産生が重要な治療的文脈、例えばmRNAワクチンにおいて特に重要です。

5'キャップアナログ

5'キャップ構造は、転写物の安定性と翻訳開始に不可欠です。合成mRNAは、キャッピング効率を高め、キャップ依存の翻訳を促進するためにキャップアナログを取り入れることがよくあります：アンチリバースキャップアナログ（ARCA）は、in vitro転写中に正しい方向を確保し、より効率的なリボソーム結合を促進します。

最適化されたUTRとコドン使用

mRNAの非翻訳領域（UTR）は、転写物の安定性と翻訳効率を決定する上で重要な役割を果たします。合成設計アプローチには以下が含まれます：

• 5'および3' UTRの工学的設計：安定化要素を含め、迅速な分解に関連する配列モチーフを減少させます。
• コドン最適化：豊富なtRNAに対応するコドンを選択することで、リボソームの停止を最小限に抑え、NGDなどの崩壊経路を引き起こす可能性のある二次構造の形成を減少させます。

mRNAデリバリーシステム

効果的なmRNAデリバリーは、治療の成功にとって重要です。さまざまなデリバリープラットフォームが開発され、mRNAを細胞外RNaseから保護し、細胞内取り込みを促進します：

• 脂質ナノ粒子（LNP）は、mRNAワクチンなどの臨床応用で最も広く使用されるデリバリー手段であり、保護的な脂質二重層を提供し、エンドソームからの脱出を促進します。
• ポリマーキャリアやリポプレックスなどの他のシステムも、mRNAの安定性とトランスフェクション効率を向上させるのに寄与します。

RNase阻害剤

in vitro転写、保存、および精製中に、合成mRNAは汚染されたRNaseによる分解に対して脆弱です。RNase阻害剤の適用は、これらのプロセス中に転写物の完全性を保つために不可欠であり、一貫した収量と生物活性を確保します。

図7. mRNAを保護するための工学的戦略。

要約すると、mRNAの酵素的分解に対する脆弱性は、生物学的特徴であり技術的な障害でもあります。自然な細胞メカニズムは、mRNAがリボヌクレアーゼや免疫検出からどのように保護されるかについて貴重な洞察を提供します。これらの洞察を革新的な合成戦略と組み合わせることで、治療用に安定で効果的なmRNA分子を設計することが可能になります。分子生物学、免疫学、バイオエンジニアリングの交差点での研究を継続することは、mRNA技術を進展させ、その完全な臨床的潜在能力を実現するために不可欠です。

Creative Enzymesでは、mRNAの安定化、in vitro転写、およびRNA処理のために設計された高品質で厳密にテストされた酵素と阻害剤を提供しています。お問い合わせいただければ、詳細情報や個別のサポートを提供いたします。